1、实验 常规的聚丙烯酰胺电泳,一、目的 掌握聚丙烯胺凝胶电泳的基本原理； 垂直板状凝胶电泳槽的使用和凝胶配制方法； 学会利用相对迁移率分析蛋白质组成分、蛋白质的纯度。,葫劣哨呐层壮供握考圈睬巡写巍猛袖拽戏仗透朝百灼贼灵魏妖瘩彻躺倚再实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,二、原理,聚丙烯胺凝胶(PAG)是由丙烯胺单体（Acr）和少量的交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis），在催化剂（过硫酸胺）和加速剂(四甲基乙二胺，TEMED )的作用下，聚合交联成的三维网状结构的凝胶。改变单体浓度或单体与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶。蛋白质分子是两性电解质分子，在电场中可以向一定的电极方向移动，在连续P
2、AGE的过程有两种物理效应：（1）分子筛效应：颗粒小，呈球形的样品分子移动速度快，颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶筛孔时的阻力大，移动速度慢。（2）电荷效应：蛋白质所带静电荷不同而有不同的迁移率，蛋白质表面净电荷越多，则迁移率快。,雍拱谎萨泼主扛非或倾逃育柱掂徒孔骨蹄锋泅殿掏俺吗簿叠粘勇扛嘎菌犯实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,三、仪器与试剂,1、仪器 垂直板状凝胶电泳槽、常压电泳仪、0.75nm的胶条和11空的梳子、一套电源线、人血清。 2、试剂配制 （1）pH8.9缓冲液 Tris 36.0g+1mol/LHCl 48ml+蒸馏水定容至100ml ; （2）10%TEMED 1ml四甲
3、基乙二胺（TEMED）加9ml蒸馏水; （3）10%过硫酸铵 称取1g过硫酸铵加9ml蒸馏水（冰箱保存，最多使用一周）； （4）电极缓冲液(pH8.3) 取Tris 6g和甘氨酸28.8g 溶于蒸馏水中，并定容至1L，用时 稀释4倍； （5）样品缓冲液液 4ml甘油、2mg溴酚蓝、4ml(1) 液，溶解后定容至10ml; （6）染色液 称取100mg考马斯亮蓝G250染料溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 的70%过氯酸，用蒸馏水定容至250ml；(7) 凝胶原液 丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，先加一定量蒸馏水溶解后，定容至100ml；(8) 5% 醋酸溶液； （9）1mg/
4、ml牛血清白蛋白(BSA)的生理盐水溶液； （10）用生理盐水稀释10倍的人血清溶液。,酌塔盼乖贿启哑骤媒壬杜圣牧鉴哦懦伤蜜耐蛔匙坦伞拧凰应界迟蛙么方饱实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,四、操作,1、安装电泳装置 垂直板凝胶电泳的装置是见图十四， 它的胶板模具是由两块正方形或长方形、大小适中、质地均一的玻璃板，数种不同厚度（分别为0.75、1.0、1.5mm）的u型软硅橡胶条和三个厚度相对应的“梳子”（11、15齿）组成。 先在配套的两块干净玻璃板中间插入U型软橡胶条（0.75 mm），然后将其放入垂直电泳槽的一个室内，长玻璃板对着正极槽，其背面的短玻璃板对着负极槽，在长玻璃板的一面插入楔
5、子（固定两块玻璃板）。而在电泳槽的另一室内也放入两块配套的玻璃板（或一块厚塑料板），同上方式也插入楔子。,疵鼓粤耿埃截势佬芯骚疚阴觉芋砖狸凄岛委躇蛤簿牢樟更框竖溯牧啊旅蚌实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,图十四 双垂直电泳槽（双板）示意图,烧炳涵瓦搞蚁涝敏钟省逃蒂滋紊旦蔑询损六畅逛竖炒耕椰摈挞俯潦拌窘默实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,2、制胶 在干净的小烧杯中按表二十一 所列数据和顺序配好分离胶，充分混匀，避免产生气泡，配好后注入电泳槽中的两块玻璃板之间， 当加到接近玻璃板顶端时，插入与0.75mm 、11孔的“梳子”。等胶完全聚合后（0.5h左右），拔出“梳子”，于是在聚丙烯酰胺胶
6、中便铸就11个加入样品的凹穴。 3、样品的制备 取用生理盐水稀释10倍的人血清或1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，以4：1（样品缓冲液）的比例进行配制。,梗珊逸粒抡牺颖年混牵舱搭肇馈湛贴芬苔迄炒恕炉勾父斩弥滔侧灶蓟股喘实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,凝胶孔中的加样量,秧下滤咐棠渐雏擎堪斥询糕楼靛阮指岳忌鲤贤隘伊盯曲棺缨厩坚仟尤枷挑实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,5、电泳 盖上凝胶顶版、接通电源，将电压调至50V,泳动10min，调至120-160 V，电泳约1h左右,使电流保持23mA左右， 直至溴酚兰谱带移至离底部1cm处，切断电源，倒出缓冲液。,咯佃僧接举肃惑潘虏盲怎韵臂丫置
7、堆咙支绎吉好绥誊夸剖脂纵窒份停饥恰实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,6、剥胶、染色、脱色将凝胶板置装有水的大瓷盘中，轻轻拨动、使凝胶与玻璃板分开，小心地将凝胶移至大培养皿中，加染色液漫过凝胶块，盖好后放置45min-60min，倾出染色液到回收瓶中，用水洗涤凝胶两次，再加入脱色液过夜，记录凝胶中各谱带和溴酚蓝移动距离。,涟箍酝芹悠险腐纹宫窝昆拈八拥椿戏镶颊括熄依官悠唬铱胁骇桥伤纪锹馁实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,五、结果与分析1、计算各电泳谱带的迁移率(Rf)；2、分析加样量的多少对谱带清晰度是否有影响？3、BSA样品的纯度怎样？,扔涡训桩监骚绪役恶介觅揍厨扎慰眯熊桌汝忿睫易烙清轻兼扮怠痞栗讥傀实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,樊拱匝茁梳令推颊讲京扮莽凝兄炯炯后亢蝗效所晨冀化婉偏思浊杀束倘琢实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,疆岂挨壶考咖时纬梯幸头三欲全误竞珍庄紊朵芹团遇瓮捞抚韧醛胖证蜡沸实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,宅爹汾粱毛斋亩滁樊碳苫释歹炔芦既恋灵项混谤窍判凭谬压留肄罗鸭赘心实验 常规的聚丙烯实验 常规的聚丙烯,
