1、附件 9细菌回复突变试验Bacterial Reverse Mutation Assay1 范 围本规范 确定 了细 菌 回 复 突 变 试 验 的基 本原则 、要 求和 方法 。本规范 适用 于化 妆品 原料 及其产 品的 基因 突变 检测 。2 定 义2.1 回 复突 变 r everse mutation细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。2.2 基 因突 变 ge ne mutation在化学 致突 变物 作用 下细 胞 DNA 中碱 基对 的排 列顺 序发生变化 。2.3 碱 基置 换突 变 b ase substitution mutation
2、引起 DNA 链上一个或几个碱基对的置换。碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。转换 是 DNA 链上 的一 个嘧 啶被另 一嘧 啶所 替代 ，或 一个嘌呤被 另 一 嘌 呤 所代 替。颠换 是 DNA 链上 的一 个嘧 啶被另 一嘌 呤所 替代 ，或 一个嘌呤被 另 一 嘧 啶 所代 替。2.4 移码 突变 f rameshift mutation引起 DNA 链 上增 加或 缺失 一个或 多个 碱基 对。2.5 细菌回复 突变试 验 bacterial reverse mutation assay利 用 一组 组 氨 酸 或 者 色 氨 酸 缺
3、陷 型 试 验菌 株测 定 引 起 细 菌碱基 置换 或 移 码 突 变的化学 物质 所诱 发的 氨 基 酸缺陷 型原养型回复 突变 的试 验方 法。2.6 S9经 多 氯 联 苯 (PCB 混 合 物 )或 苯 巴 比 妥 钠 和 -萘 黄 酮 结 合 诱导 的 大 鼠 制 备 肝 匀 浆 ，在 9000g 下离 心 10min 后的 肝匀浆 上清液。3 原 理鼠伤寒 沙门 氏组 氨酸 营养 缺陷型 菌株 不能 合成 组氨 酸， 故 在缺 乏组 氨酸 的培 养基 上 ，仅少数自 发回 复突 变的 细菌 生长；大肠杆菌色 氨酸 营养 缺陷型 菌株 不能 合成 色 氨 酸， 故 在缺 乏色 氨酸
4、 的培 养基 上 ，仅少数自 发回 复突 变的 细菌 生长。 假如 有致 突变 物存在， 则 营养 缺陷 型的 细菌 回复突 变成 原养型，因 而能 生长 形成 菌落 ，据 此 判 断 受试 物 是 否为 致突变 物。某些致 突变 物需 要代 谢活 化后才 能引 起回 复突 变 ，故 需加入经诱 导 剂 诱 导 的大 鼠肝 制 备的 S9 混合 液。4 仪 器 和 设 备培 养箱 、恒 温水 浴、 振 荡水浴 摇床 、压 力蒸 汽消 毒器、 干热 烤箱 、低 温冰 箱（ 80） 或液氮生物 容器 、普通 冰箱 、天平( 精 密度0.1g 和 0.0001g)、混 匀振 荡器 、匀浆 器 、菌落
5、计 数器 、低温高 速离心机 ，玻 璃 器 皿、生物安全柜等。5 培 养 基 和 试 剂5.1 0.5mmol/L 组氨酸 0.5mmol/L 色氨酸 0.5mmol/L 生物素溶 液成分： L-组 氨酸（MW155 ） 78mgD-生物素（MW244 ） 122mgL-色氨酸（ MW204） 102mg加蒸馏水/去离子水至 1000mL配制 ：将 上 述 成 分 加 热 ，以 溶 解 生 物 素 ，然 后 在 0.068MPa 下 高压 灭 菌 20min。贮 于 4 冰箱 。若试验中不使用大 肠杆菌，则不添加色氨酸。5.2 顶层 琼脂 培养 基成分： 琼脂粉 1.2g氯化钠 1.0g加蒸馏
6、水/去离子水至 200mL配制 ：上 述成 分混 合后 ，于 0.103MPa 下 高压 灭 菌 30min。实验 时 ，加 入 0.5mmol/L 组 氨 酸 0.5mmol/L 色 氨 酸 0.5mmol/L 生物素溶液 20mL。若试验中不使用大肠 杆菌，则不添加色氨酸。5.3 Vogel-Bonner(V-B)培养 基 E成分： 枸 橼酸 (C6H8O7H2O) 100g磷 酸氢 二钾( K2HPO4) 500g磷 酸氢 铵钠( NaNH4HPO44H2O) 175g硫 酸镁 (MgSO47H2O) 10g加 蒸馏 水/ 去离子水至 1000mL配制：先将前三种成分 加热溶解后，再将溶
7、解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水/去离子水至 1000mL。于 0.103MPa 下高压 灭 菌 30min。储 于 4冰箱 。5.4 20%葡 萄糖 溶液成分： 葡 萄糖 200g加 蒸馏 水/ 去离子水至 1000mL配 制 ：加 少 量 蒸 馏 水 /去离子水加 温 溶 解 葡 萄 糖 ，再 加 蒸 馏 水 /去离子水至 1000mL。于 0.068MPa 下高 压 灭 菌 20min。储 于 4 冰箱 。5.5 底层 琼脂 培养 基成分： 琼 脂粉 7.5g蒸 馏水/去离子水 480mLV-B 培养 基 E 10mL20%葡 萄糖 溶液 10mL配制 ：首 先将 前两 种成 分 于
8、 0.103MPa 下 高压 灭菌 30min 后，再 加入 后两 种成 分， 充分混匀倒 底层 平 板。 按每 皿 25mL 制备平板， 冷 凝固 化 后倒置 于 37 培养 箱中 24h，备用。5.6 营养 肉汤 培养 基成分： 牛 肉膏 2.5g胰胨 5.0g磷 酸氢 二钾( K2HPO4) 1.0g加 蒸馏 水/ 去离子水至 500mL配制 ：将 上述 成分 混 合后， 于 0.103MPa 下高压 灭菌 30min。储于 4冰 箱 。5.7 盐溶 液 (1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)成分： 氯 化钾 (KCl) 61.5g氯 化镁 (MgCl26H2O)
9、40.7g加 蒸馏 水/ 去离子水至 500mL配制 ：在 水中 溶解 上述 成分后 ，于 0.103MPa 下高 压灭 菌30min。储 于 4 冰 箱。5.8 0.2mol/L 磷酸盐缓 冲 液( pH7.4)成分： 磷 酸二 氢钠( NaH2PO42H2O) 2.965g磷 酸氢 二钠( Na2HPO412H2O) 29.015g加 蒸馏 水/ 去离子水至 500mL配制 ：溶 解上 述成 分后 ，于 0.103MPa 下高 压灭 菌 30min。储于 4 冰箱 。5.9 S9 混 合液成分： 每毫 升 S9 混合 液肝 S9 100l盐溶 液 20l灭菌 蒸馏 水/去离子水 380l0
10、.2mol/L 磷酸盐缓 冲液 500l辅 酶 II(NADP) 4mol6-磷酸葡 萄糖 (G-6-P) 5mol配制 ：将辅 酶 II 和 6-磷酸葡萄 糖置 于灭 菌三 角瓶 内称重 ，然后 按上 述相 反 的次序 加入各种成 分，使 肝 S9 加到 已 有缓冲 液的溶液 中 。该 混 合液必 须临 用现 配， 并保 存于冰 水浴 中。实验结 束，剩 余 S9 混合 液 应该丢 弃。5.10 菌株 鉴定 用和 特殊 用途试 剂5.10.1 组 氨酸 -色氨酸-生 物素 平 板成分： 琼脂 粉 15g蒸 馏水/去离子水 934mL(V-B)培养 基 E 20mL20%葡 萄糖 20mL灭菌
11、 盐酸 组氨 酸 水溶液( 0.5g/100mL) 10mL灭菌 盐酸 色氨 酸 水溶液( 0.5g/100mL) 10mL灭菌 0.5mmol/L 生物素 溶液 6mL配 制： 高压 灭菌 琼脂 和水后 ，将 灭 菌 20%葡萄 糖， V-B 培养 基、组氨 酸 溶液， 加 进热 的琼脂溶液 中（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸馏水/去离子水改为 944mL）。待溶 液稍微 冷 却后， 加入 灭菌 生物 素， 混匀， 浇制 平板 。5.10.2 氨 苄青 霉素 平板 和 氨苄青 霉素/ 四环 素平 板成分： 琼 脂粉 15g蒸 馏水/去离子水 930mL(V-B)盐 溶液 20
12、mL20%葡萄 糖 20mL灭 菌盐 酸组 氨 酸溶液 （0.5g/100mL） 10mL灭菌 盐酸 色氨 酸 水溶液( 0.5g/100mL) 10mL灭 菌 0.5mmol/L 生物素溶液 6mL氨 苄青 霉素 溶 液( 8mg/mL 于 0.02mol/L NaOH 中)3.15mL四 环素 溶液( 8mg/mL 于 0.02mol/L HCl中)0.25mL配制 ：琼 脂 和 水 高 压 灭 菌 20min，将 无 菌 的 葡 萄 糖 、VB 盐 溶液 、组 氨 酸 溶 液 和 色 氨 酸 溶 液 ，加 进热 的琼脂溶液 中， 混 匀 （若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸馏
13、水/去离子水改为加 940mL）。冷 却 至 大 约 50 ，无 菌 条 件 下 加 入 四 环 素 溶 液 和 /或 氨 苄 青 霉 素 溶 液 。应该在 倾注 琼脂 平板 后几 天内， 制备 主平 板。5.10.3 营 养琼 脂平 板成分： 琼脂 粉 7.5g营养 肉汤 培养 基 500mL配 制： 于 0.103MPa 下 高压灭 菌 30min 后倾注 平 板。6 试 验 菌 株 及 其 生 物 学 特 性 鉴 定6.1 试验 菌株采 用 以 下 菌 株 作 为 标 准 组 合 ：鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 TA1535；鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 TA97 或 TA97a 或 TA1
14、537；鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 TA98；鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 TA100；鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 TA102 或大肠杆菌 WP2uvrA 或大肠杆菌WP2uvrA（pKM101）；6.2 生 物学 特性 鉴定新获得 的或 长期 保存 的菌 种， 在 试验 前必 须进 行菌 株的生 物特 性鉴 定。 菌株 鉴定 的 判断标准， 如 表 1 所 示。表 1 试验 菌株 鉴定 的判 断标准自发回 变菌落参考数 *菌株组氨酸缺陷色氨酸缺陷脂多糖 屏障缺损氨苄青 霉素抗性切除修 复缺损四环素抗性 Ames 实验室 Zeiger 实验室TA97 + / + + + - 90180* 752
15、00*TA97a + / + + + - 90180* 75200*TA98 + / + + + - 3050 2050TA100 + / + + + - 100200 75200TA102 + / + + - + 240320* 100400*TA1535 + / + - + - 1035 520TA1537 + / + - + - 315 520WP2uvrA / + / - + - / 520WP2uvrA（pKM101） / + / + + - / 100200注“+”表示需要组氨 酸“+”表示需要色氨 酸“+”表示具有rfa 突 变“+”表示具有 R 因子“+”表 示对于鼠伤寒沙门氏
16、菌具有uvrB 突变，对于大肠杆菌，具有uvrA 突 变“+”表 示具有pAQ1 质粒*在体外代谢活化 条件下自 发回变菌落数略增。对于各菌的自发回变范围，各个实验室在参考其他实验室数据的基础上应建立自己的历史对照数据库，形成适合本实验室条件的适用范围。同时，实验室背景数据应当与文献报道相符。6.2.1 组氨 酸缺 陷/色氨酸缺陷原 理 ：组 氨 酸 缺 陷 型 试 验菌 株 本 身 不 能 合 成 组 氨 酸， 只 能 在补 充 组 氨 酸 的 培养 基 上生长 ，而 在缺 乏组 氨酸 的培养 基上 ，则 不能 生长 。色氨酸缺陷试 验菌 株 本 身 不 能 合 成 色 氨 酸， 只 能 在
17、 补 充 色氨 酸 的 培 养 基 上生长 ，而 在缺 乏色 氨酸 的培养 基上 ，则 不能 生长 。鉴 定 方 法 ：将 测 试 菌株 增菌 液 分 别 于 含 组 氨 酸 或 者 色 氨 酸培养基 平 板 和 无 组 氨 酸 或 者 色 氨 酸 平板 上划 线 ，于 37下 培 养24h 后观 察结 果。结果判 断 ：组 氨酸 缺陷 型菌 株在含 组氨 酸平 板上 生长 ，而在无组氨 酸 平 板 上 则不 能 生 长 ；色 氨酸 缺陷 型菌 株在含 色氨 酸平 板上生长 ，而在 无 色氨 酸平 板上 则不 能生 长 。6.2.2 脂多 糖屏 障缺 损原理 ：具 有深 粗糙 （rfa）的菌株
18、 ，其表 面一 层脂 多 糖屏障 缺损 ，因此 一 些 大 分子物 质 ,如结晶紫 能穿 透菌 膜进 入菌 体，从 而抑 制其 生长 ，而 野生型 菌 株 则不 受其 影响 。鉴定方 法： 吸取 待测 菌株 增菌液 0.1mL 于营养琼 脂 平板上 划线 ，然 后将 浸湿 的 0.1%结晶紫溶 液滤 纸 条 与划 线处 交叉放 置。37 下 培 养 24h 后观 察结 果。结果判 断 ：假 若待 测菌 在滤 纸条与 划线 交叉 处出 现一 透明菌带 ，说 明该 待测 菌株 具有 rfa 突变。6.2.3 氨苄 青霉 素抗 性原理： 含 R 因 子的 试验 菌 株对氨 苄青 霉素 有抗 性。 因
19、为 R 因子不 太 稳 定 ，容 易丢 失 ，故用氨 苄青 霉 素 确定 该质 粒存在 与否 。鉴定方 法 ：吸 取待 测菌 株 增菌 液 0.1mL，在氨苄 青 霉素平 板上 划线 ，37 下 培养 24h 后观察结 果。结果判 断； 假若 测试 菌在 氨 苄青霉 素平 板上 生长 ，说 明 该测试菌具 有 抗 氨 苄 青霉 素作 用 ，表示 含 R 因子 ，否 则， 表 示测试 菌不含 R 因 子或 R 因子丢 失。6.2.4 紫外 线敏 感性原理： 具有 uvrB/A 突变 的 菌株对 紫外 线敏 感， 当受 到紫外线照 射 后 ，不 能生 长 ，而 具有野生型 切除 修复 酶的 菌株
20、，则能 照常 生长 。鉴定方 法： 吸取 待测 菌株 增菌 液 0.1mL 于营养琼脂 平板上 划线 ，用 黑纸 盖住 平板 的 一半，置 紫外 灯 下 照射 （15W，距 离 33cm）8 秒钟 。置 37下 孵育 24h 后观 察 结果。结果判 断： 具 有 uvrB/A 突 变的菌 株对 紫外 线敏 感， 经辐射后细 菌 不 生 长 ，而 具有 完 整地切除修 复系 统的 菌株 ，则 照常生 长。6.2.5 四环 素抗 性原理： 具 有 pAQI 的菌 株 对四环 素有 抗性 。鉴定方 法： 吸取 待测 菌株 增菌 液 0.1mL 于氨苄青霉 素/ 四环素平 板 上 划 线 ，置 37下
21、 孵 育 24h 后观 察结 果。结 果 判断 ：假 若测 试菌 照常 在 氨苄 青霉 素 /四 环素 平板 上 生长 ，表 明该 测试 菌株 对 氨苄青霉素 和四 环素 两者 有抗 性，具 有pAQI 质粒 ，否 则，说 明测 试菌 株不 含 pAQI 质粒。6.2.6 自发 回变原理： 每种 试验 菌株 都以 一定的 频率 自发 地产 生回 变， 称 为自 发回 变。 这 种 自发回 变是每种试 验菌 株的 一项 特性 。鉴定方 法： 将待 测菌 株增 菌液 0.1mL 加到 2mL 含 组氨酸 -色氨 酸 -生 物素 的顶 层琼 脂培养 基 的试管 内 （若试验中不使用大肠杆菌，则不添加
22、色氨酸），混 匀后 铺到 于 底 层琼脂 平板 上， 待琼 脂固 化后 ，置 37 培养 箱中 孵 育 4872h 后 记数每皿回 变菌 落数 。结果判 断： 每种 标准 测试 菌株的 自发 回变 菌落 数应 符合 表 1要 求。 经体 外代 谢活 化 后 的自发回 变菌 落数 ，要 比直 接作用 下的略高 。6.2.7 回变 特性 -诊 断 性 试验原理： 每种 试验 菌株 对诊 断性诱 变剂 回变 作用 的性 质以 及S9 混 合 液的 效应 不 一。鉴定方 法： 按照 平板 掺入 试验的 操作 步骤 进行 。将 受试物 换成 诊断 性诱 变剂 。结果判 断： 标准 菌株 对某 些诊断 性
23、诱 变剂 特有 的回 变结果 参见 表 2。表 2 测 试菌 株的 回变 性诱变剂 剂量(g/皿) S9TA97TA98TA100TA102 TA1535 TA1537 WP2uvrAWP2uvrA（pKM101）柔毛霉 素 6.0 - 124 3123 47 592 / / / /叠氮化 钠 1.5 - 76 3 3000 188 320(0.5g) / / /ICR-191 1.0 - 1640 63 185 0 / / / /链霉黑 素 0.25 - inh inh inh 2230 / / / /丝裂霉 素C 0.5 - inh inh inh 2772 / / / /2,4,7-三硝
24、基- 9-芴酮 0.20 - 8377 8244 400 16 / / / /4-硝 基 -O-次苯二胺 20 - 2160 1599 798 0 / / / /4-硝基 喹 啉-N-氧化物 0.5 - 528 292 4220 287 / / 610 /甲基磺 酸甲酯 1.0(l) - 174 23 2730 6586 / / / /敌克松 50.0 - 2688 1198 183 895 / / / /9-氨基吖啶 50 - / / / / / 337 / /2-氨基芴 10 + 1742 6194 3026 261 / / / /苯并（ a）芘 1.0 + 337 143 937 255
25、 / 110(5g) / /2-氨基蒽 20 + / / / / 380(5g) / 300 /注： inh 表示 抑菌 。7 大 鼠肝 微粒 体酶 的诱 导 和 S9 的制 备7.1 诱导选择健 康雄 性 成 年大 鼠， 体重 200g 左 右。 将多 氯联 苯（ PCB混 合物 ）溶 于玉 米油 中 ，浓度 为 200mg/mL，按 500mg/kg 体重一次 腹腔 注射 ，5d 后处 死动 物， 处死 前 禁食 12h。也 可 采 用 苯 巴 比 妥 钠 和 -萘 黄 酮 联 合 诱 导 的 方 法 进 行 制备 。经 口 或 腹 腔 注 射 给 予 80mg/kg 苯巴 比 妥钠 和
26、80mg/kg -萘黄酮，连 续 3 天 ，处死 前禁 食 16h。7.2 S9 制备首先， 用 75%酒 精消 毒动 物皮毛 ，剖 开腹 部。 在无 菌条件 下，取出 肝 脏 ，去 除肝脏 的结缔组织 ，用 冰浴的 0.15mol/L 氯化钾溶液 淋洗 肝脏 ，放入盛 有 0.15mol/L 氯化钾溶液 的烧 杯里 。按每 克肝 脏加 入 0.15mol/L 氯化钾溶 液 3mL。用电动匀 浆器 制成 肝匀 浆 ，再在低 温高 速离心机 上， 在 4 条件 下 ，以 9000g 离 心 10min，取其上 清液 （S9）分 装于 塑料管 中。 每管装 2mL3mL。储存于液氮生 物容 器中
27、或 80冰 箱中备 用。上述全 部操 作均 在冰 水浴 中和无 菌条 件下 进行 。制 备肝 S9所 用一 切手 术器 械 、器皿 等，均经灭 菌 消 毒。 S9 制备 后 ，其活 力需经诊 断 性 诱 变 剂进行 鉴定 。8 溶 剂的 选择如果受 试物 为水 溶性 ，可 用灭菌 蒸馏 水/ 去离子水作 为溶 剂；如为脂 溶性 ，应 选择 对试 验菌株 毒 性低且无致突变性的有机溶 剂，常用的有二甲基亚砜 （DMSO）、丙酮、 95%乙 醇。一般操作中 ，为了 减 少 误 差和 溶剂的 影响， 常按 每皿使 用剂量 用同一 溶剂 配成不 同的 浓 度，固 定加入量 为 100l。9 剂 量的
28、设计决定受 试物 最高 剂量 的标 准是对 细菌 的毒 性及 其溶 解度 。自发回 变 数 的 减 少 ，背 景菌 变得清晰 或被 处理 的培 养物 细菌存 活数减少 ，都 是 毒 性的标 志。对原料 而言 ，一般 最高 剂 量组可 为 5mg/皿或 5l/皿 。对产 品而 言， 有 杀菌 作用 的受 试 物，最高剂 量 可 为最 低抑 菌浓 度， 无杀 菌作 用的 受 试 物 ，最 高剂 量可 为原液 。受 试物至 少应 设四个剂量 组。每个 剂 量 均 做 三个平 行平 板。10 试 验操 作步 骤10.1 增菌 培养取营养肉汤培养基 5mL，加入无菌试管中，将主 平 板或冷冻保存的菌株培
29、养 物接种于营养肉 汤培 养 基 内 ，37振 荡 （100 次/min）培养 10h。该菌株 培养 物应 每毫 升 不 少于 1-2109 活菌数 。10.2 平板 掺入 法实验时 ，将 含 0.5mmol/L 组氨酸 0.5mmol/L 色 氨 酸 -0.5mmol/L 生物素 溶液（若 试验中不使用大 肠杆菌，则不添加色氨酸）的 顶层 琼脂 培养 基 2.0mL 分装于 试管 中， 45 水浴中 保 温，然 后每 管依 次加入 试 验菌株 增菌 液 0.1mL，受试物溶 液 0.1mL 和磷酸盐缓冲液 0.5mL 或者 S9 混合 液 0.5mL（需代谢活化 时） ，充 分混 匀， 迅
30、速倾入 底层 琼脂 平板 上， 转动 平 板， 使之分布 均匀 。水 平放 置待 冷 凝固 化 后， 倒置 于 37培 养箱 里 孵 育 4872h。记数 每皿 回变 菌 落 数 。实验中 ，除 设受 试物 各剂 量组外 ，还 应同 时设 空白 对照、 溶剂对照 、阳 性 诱 变剂对 照和无菌对 照。11 数据 处理 和结 果判 断记录受试 物各 剂量组 、空 白对照（ 自发 回变） 、溶剂 对照以及阳性 诱变 剂 对照 的每皿 回变菌落 数， 并求 平均 值和 标准差 。如果受 试物 TA1535、TA1537、WP2uvrA 的回 变菌 落数 是溶剂 对照 回变 菌落 数的 三倍或 三倍
31、以上 ，受 试物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回变菌 落 数 是溶 剂 对照 回变 菌落 数的 二倍 或 二倍 以上 ，并出现以下情形之一，则 该受 试物 判定 为致突 变阳 性，（1）呈剂 量- 反应关系（2）任 何一个 剂量 条件 下， 出现 阳性反 应并 有 可重复性受试物 经上 述五 个试 验菌 株测定 后， 只要 有一 个试 验菌株 ，无 论在 加 S9 或未 加 S9 条件下为阳 性， 均可 报告 该受 试物细 菌 回复 突 变 试 验 为 致突变 阳性 。如果受 试物 经五 个试 验菌 株检测 后，无论 加 S9 和未 加 S9 均为 阴性， 则可 报 告 该受试 物为致突 变阴 性。
