1、质控菌种管理规定微生物实验用菌种是进行新产品研发和生产质量控制的标准物质。为了保证微生物实验的准确灵敏和人员及环境的卫生安全，特制定以下规定：1. 菌种采集。实验室用菌种一是到国家法定机构采购，二是购买 ATCC 菌种，三是科研中菌种交流。不管是哪种来源，均由公司统一采集。采集中严格按照规范执行。要求包装可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保证菌种合格和环境安全。采集中要有菌种传代标识。2.菌种的活化：购买的标准菌种必须要求是冻干粉，科研中菌种交流可以为斜面或液体。菌种的首次活化最好是在非选择性琼脂培养基上，除非特殊情况或特别推荐，一般不用液体培养基。具体使用培养基的情况如下表，详细菌种使用方法见附
2、表：方 法 培养基方法 1 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，非选择性羊血琼脂，PCA 或营养琼脂，35 正常环境培养 24-48 小时。方法 2 非选择性羊血琼脂，35正常环境培养 24-48 小时。方法 3 巧克力琼脂平板，355-10%CO2 环境培养 24-48 小时。方法 4 CDC 厌氧血琼脂 35厌氧培养 48-72 小时；部分专性厌氧菌能需要 5-7 天，才能充分生长；对于梭菌，以下新鲜培养基也可选用：营养琼脂，TSA 琼脂，PCA 琼脂，需培养 48-96 小时。方法 5 沙堡氏葡萄糖 Emmons 琼脂 25-28培养 3-7 天；也可用 PDA 琼脂。方法 6 巧克力琼脂平板，
3、35微需氧环境培养 48-72 小时。方法 7 改良罗氏琼脂或 Middlebrook 琼脂，355-10%CO2 或正常环境培养 7 天。方法 8 缓冲活性碳酵母提取物琼脂，35正常环境培养 3-5 天。方法 9 巧克力琼脂平板，355-10%CO2 环境培养 48 小时。方法 10 先用脑心浸出液肉汤或 TSB 培养基 35增菌培养 18-24 小时，再划线至 TSA 琼脂 35正常环境培养 24-48 小时。方法 11 先接种于 MRS 肉汤 35增菌培养 24-48 小时，再划线接种至含羊血的哥伦比亚 CNA 培养基 355%CO2 环境培养 24-48 小时。方法 12 PDA 琼脂
4、 45正常环境培养 48-72 小时。方法 13 先接种于 10B 精氨酸肉汤，作系列梯度稀释 35正常培养至培养基变成粉红色，接入 A-8 琼脂。3.菌种保存。所有菌种均由实验室专人(双人双锁)保存于专用冰箱或其它保存方式。要建立菌种登记台帐，详细记录菌种采集、保管、制备、使用、处置情况；每一种菌种一定要有本公司的检测鉴定报告（具体的的鉴定方法见 ATCC 提供的菌种证书方法）；具体菌种保存方法如下：3.1 干粉菌种：购买的干粉菌种保存于 2-8冰箱中，可保存 3-5 年。3.2 斜面菌种或液体菌种：3.2.1 液氮罐保存方法：用于第一代菌种的长期保存，每种菌种保存 5 管。（1）准备用于液
5、氮保藏的安瓿管或菌种保存管( 塑料)，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用 7510mm 的，或能容 12mm 液体的。（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞， 121灭菌 15 分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如 10的甘油蒸馏水溶液或 10二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用 121灭菌 15 分钟。（3）接入菌种：将菌种用 10的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有
6、保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降 1的慢速冻结至-30。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。（5）保藏经冻结至-30 的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150，液态氮内为-196 。（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入 38-40的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬
7、菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。3.2.2 液体石蜡保存法：将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎， 121灭菌 30 分钟，然后放在 40温箱中，使水汽蒸发掉，备用。将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端 1cm 为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。1）大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌属、沙门氏菌属、副伤寒沙门氏菌、李斯特氏菌属、蜡样芽胞杆菌、八叠球菌、短芽孢杆菌、大肠杆菌 HB101、大肠杆菌
8、 DH5a、猪肺疫、禽多杀性巴氏杆菌（禽霍乱）、猪丹毒、大肠杆菌 O157、大肠菌群、产气肠杆菌、志贺氏菌属；接种于半固体培养基上，361培养 18-24 小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于 2-8冰箱或室温中。可保存 1-2 年。注：副溶血性弧菌接种于含盐的半固体培养基上，361培养 18-24 小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于室温。2）产气荚膜梭菌、梭杆菌属、拟杆菌属等厌氧菌、厌氧消化链球菌：接种于 CDC 厌氧菌琼脂中，培养 18-24 小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于 2-8冰箱或室温中。可保存 1-2年。3）酵母菌：接种于 YPD 培养基中，28培养 24-48 小时，加入无菌石蜡油覆
9、盖，保存于2-8 冰箱或室温中。可保存 1-2 年。4）霉菌、白色念珠球菌：接种于 PDA 培养基中，28培养 24-48 小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于 2-8冰箱或室温中。可保存 1-2 年。5）链球菌属：接种于羊血琼脂，361培养 24-48 小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8 冰箱或室温中。可保存 1-2 年。6)副嗜血杆菌、淋病奈瑟菌(需 5-10%CO2 环境)、脑膜炎奈瑟菌(需 5-10%CO2 环境) 、流感嗜血杆菌接种于巧克力琼脂，361培养 24-48 小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于 2-8冰箱或室温中。可保存 1-2 年。7）分枝杆菌属：接种于改良罗氏琼脂或 Middlebrook 琼脂 361培养 7 天，加入无菌石蜡油覆盖，保存于 2-8冰箱或室温中。可保存 1-2 年。
