1、酶工程酶工程综述胰蛋白酶一 摘要胰蛋白酶为蛋白酶的一种，在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。在生物体内，胰蛋白酶抑制剂可以调控很多重要的生理过程，在疾病的临床诊断、治疗等方面都有广阔的应用前景。酶工程二 胰蛋白酶的简介胰蛋白酶为蛋白酶的一种，在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽
2、链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。在生物体内，胰蛋白酶抑制剂可以调控很多重要的生理过程，在疾病的临床诊断、治疗等方面都有广阔的应用前景。广泛的应用于急性胰腺炎、外科手术、脑血管疾病、妇产科疾病、休克以及抗肿瘤治疗中新型药物的开发。牛 的 胰 蛋 白 酶 氨 基 酸 残 基 223 个 ， 分 子 量 为 23300， 活 性 部 位 的 丝 氨 酸残 基 是 不 可 缺 少 的 丝 氨 酸 蛋 白 酶 。
3、 除 存 在 于 脊 椎 动 物 外 ， 还 存 在 于 蚕 、 海 盘车 、 蝲 姑 、 放 线 菌 等 范 围 广 泛 的 生 物 体 中 。 另 外 与 高 等 动 物 的 血 液 凝 固 和 炎症 等 有 关 的 凝 血 酶 、 纤 溶 酶 、 舒 血 管 素 等 蛋 白 酶 在 化 学 结 构 和 特 异 性 等 方 面与 胰 蛋 白 酶 具 有 密 切 的 关 系 ， 可 以 认 为 这 些 酶 是 从 共 同 的 祖 先 酶 在 进 化 过 程中 分 化 而 来 的 。 胰 糜 蛋 白 酶 与 弹 性 蛋 白 酶 在 结 构 和 催 化 机 制 方 面 也 具 有 密 切关 系
4、， 但 其 特 异 性 则 完 全 不 同 。胰 蛋 白 酶 系 自 牛 、 羊 或 猪 胰 中 提 取 的 一 种 蛋 白 水 解 酶 。 中 国 药 品 标 准 规定 按 干 燥 品 计 算 ， 每 1mg 的 效 价 不 得 少 于 2500 单 位 。 由 牛 、 羊 、 猪 胰 脏提 取 而 得 的 一 种 肽 链 内 切 酶 ， 只 断 裂 赖 氨 酸 或 精 氨 酸 的 羧 基 参 与 形 成 的 肽 键 。白 色 或 米 黄 色 结 晶 性 粉 末 。 溶 于 水 ， 不 溶 于 乙 醇 、 甘 油 、 氯 仿 和 乙 醚 。 分 子量 24 000， pI 10.5， 最 适
5、 pH 值 7.8 8.5 左 右 。 pH9.0 不 可 逆 失 活 。Ca2+对 酶 活 性 有 稳 定 作 用 ； 重 金 属 离 子 、 有 机 磷 化 合 物 、 DFP、 天 然 胰 蛋 白酶 抑 制 剂 对 其 活 性 有 强 烈 抑 制 。 临 床 用 于 抗 炎 消 肿 ， 工 业 上 用 于 皮 革 制 造 、生 丝 处 理 、 食 品 加 工 等 。三 胰蛋白酶的作用胰 蛋 白 酶 为 蛋 白 质 水 解 酶 ， 能 选 择 地 水 解 蛋 白 质 中 由 赖 氨 酸 或 精 氨 酸 的羧 基 所 构 成 的 肽 链 ， 能 消 化 溶 解 变 性 蛋 质 ， 对 未 变
6、 性 的 蛋 白 质 无 作 用 ， 因 此 ，能 使 脓 、 痰 液 、 血 凝 块 等 分 解 、 变 稀 ， 易 于 引 流 排 除 ， 加 速 创 面 净 化 ， 促 进肉 芽 组 织 新 生 ， 此 外 还 有 抗 炎 症 作 用 。 临 床 上 用 于 脓 胸 、 血 胸 、 外 科 炎 症 、溃 疡 、 创 伤 性 损 伤 、 瘘 管 等 所 产 生 的 局 部 水 肿 、 血 肿 及 脓 肿 等 。 喷 雾 吸 入 ，用 于 呼 吸 道 疾 病 。 也 可 用 于 治 疗 毒 蛇 咬 伤 。 还 常 用 于 动 物 细 胞 培 养 前 对 组 织的 处 理 。胰 蛋 白 酶 的
7、 作 用 是 使 细 胞 间 的 蛋 白 质 水 解 从 而 使 细 胞 离 散 。 不 同 的 组 织或 者 细 胞 对 胰 酶 的 作 用 反 应 不 一 样 。 胰 酶 分 散 细 胞 的 活 性 还 与 其 浓 度 、 温 度和 作 用 时 间 有 关 ， 在 pH 为 8.0 、 温 度 为 37 时 ， 胰 酶 溶 液 的 作 用 能 力最 强 。 使 用 胰 酶 时 ， 应 把 握 好 浓 度 、 温 度 和 时 间 ， 以 免 消 化 过 度 造 成 细 胞 损伤 。 因 Ca2+ 、 Mg2+ 和 血 清 、 蛋 白 质 可 降 低 胰 酶 的 活 性 ， 所 以 配 制 胰
8、 酶 溶液 时 应 选 用 不 含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ， 如 ： D-Hanks 液 。 终 止 消 化 时 ，可 用 含 有 血 清 培 养 液 或 者 胰 酶 抑 制 剂 终 止 胰 酶 对 细 胞 的 作 用 。三 胰蛋白酶的制备酶工程从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节 pH 以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活
9、，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经过 23 次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到 800010000BAEE 单位/毫克蛋白，或更高。试剂和器材1试剂（1）pH2.5 乙酸酸化水。（2）2.5mol/L H 2SO4。（3）5 mol/L NaOH。（4）2 mol/L NaOH。（5）2mol/L HCl。（6）0.001M HCl。（7）硫酸铵。（8）氯化钙。（9）0.8 mol/L pH9.0 硼酸缓冲液：取 20ml 0.
10、8 mol/L 硼酸溶液，加 80ml 0.2 mol/L 四硼酸钠溶液，混合后，用 pH 计检查校正。（10）0.4 mol/L pH9.0 硼酸缓冲液（用 0.8 mol/L 稀释 1 倍即可）；（11）0.2 mol/L pH8.0 硼酸缓冲液：取 70ml 0.2 mol/L 硼酸溶液，加 30ml 0.5 mol/L 四硼酸钠溶液，混合后，用 pH 计校正。（12）0.05 mol/L pH8.0 TrisHCl 缓冲液：取 50mL 0.1 mol/LTris 加 29.2 mL mol/L HCl 加水定容至 100mL。（13）底物溶液的配制：即每毫升 0.05 mol/L p
11、H8.0 TrisHCl 缓冲液中加0.34mgBAEE 和 2.22mg 的氯化钙。2、器材（1）新鲜或冰冻猪胰脏（2）食品加工机和高速分散器。（3）研钵。（4）大玻璃漏斗。（5）布氏漏斗。（6）抽滤瓶。（7）纱布。（8）恒温水浴。（9）紫外分光光度计。（10）秒表。酶工程（11）pH 试纸。操作方法1猪胰蛋白酶制备（1）猪胰蛋白酶原的提取猪胰脏 1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。 加入 2 倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于 1015搅拌提取 24 小时，四层纱 布过滤得乳白色滤液，用 2.5M H2SO4调 pH 至 2.53.0，放置 34 小时后用
12、折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约 1.5L）。加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达 0.75 饱和度（每升滤液加 492 克）放置过 夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品。（2）胰蛋白酶原激活向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入 10 倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶 解，得胰蛋白酶原溶液。将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计），使 Ca2+与 SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶液中最终仍含有 0.1M CaCl2。用 5M NaOH 调 pH 至 8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约 2-5mg）轻轻搅拌，于室温下活化 810h，（23
13、 小时取样一次，并用 0.001M HCl 稀释），测定酶活性增加的情况。活化完成（比活约 35004000BAEE 单位）后，用 2.5M H2SO4调 pH 至2.53.0，抽滤除去 CaSO4 沉淀。（3）胰蛋白酶的分离将已激活的胰蛋白酶溶液按 242g/L 加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到 0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼。2滤液按 250g/L 加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到 0.75，放置数小时，抽滤，弃去滤液。（4）胰蛋白酶的结晶将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0 的 0.4M 硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解
14、。用 2M NaOH 调 pH 至 8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的 1/41/5的 pH8.0 的 0.2M 硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。放置 25 天可得到大量胰蛋白酶结晶，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收。（5）胰蛋白酶的重结晶将第一次结晶的胰蛋白酶产物进行重结晶：用约 1 倍的 0.025M HCl，使上述结晶分散，加入约 1.01.5 倍体积的 pH9.0 的 0.8M 硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用 2M NaOH 调溶液 pH 至 8.0（准确）（体积
15、过大，很难结晶），冰箱放置 12 天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。酶工程2胰蛋白酶活性的测定以苯甲酰 L精氨酸乙酯（英文缩写为 BAEE）为底物，用紫外吸收法进行测定。苯甲酰 L精氨酸乙酯在波长 253nm 下的紫外吸收远远弱于苯甲酰 L精氨酸（英文缩写为 BA）。在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰 L精氨酸逐渐增多，反应体系的紫外吸收宜随之相应增加。取 2 个光程为 1 厘米的带盖石英比色杯，分别加入 25予热过的 2.8ml 底物溶液。向一只比色杯中加入 0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的253nm 处光
16、吸收零点。再在另一比色杯中加入 0.2ml 待测酶液（用量一般为 10微克结晶的胰蛋白酶），立即混匀并记时，每半分钟读数一次，共读34min。控制 DA253/min 在 0.05 0.100 左右为宜。绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率（即初速度）DA253/min。胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以 BAEE 为底物反应液 pH8.0，25，反应体积 3.0ml，光径 1 厘米的条件下，测定 DA253，每分钟使 DA253 增加0.001，反应液中所加入的酶量为一 BAEE 单位。临床应用在生物体内，胰蛋白酶抑制剂可以调控很多重要的生理过程，在疾病的临床诊断
17、、治疗等方面都有广阔的应用前景。广泛的应用于急性胰腺炎、外科手术、脑血管疾病、妇产科疾病、休克以及抗肿瘤治疗中新型药物的开发。1、治疗急性胰腺炎(Acute Pancrititis，AP) AP 的发病机制与蛋白酶级联反应、血液循环障碍、白细胞过度激活产生的细胞因子和炎症介质有关。AP 发病时多种酶在胰腺内过度积累，引起胰腺本身的炎症及缺血性坏死，炎性介质进一步的释放可以导致全身性的炎性反应综合征，严重时导致患者全身器官衰竭而死。UTI 可以抑制 AP 的蛋白酶活性，通过抑制钙离子内流来抑制血管平滑肌的收缩，增加胰腺的血流量，保护血管内皮细胞免受氧自由基等的损伤，防止微血栓形成，改善胰腺的血液
18、循环；能有效地减少炎症介质的释放。TI 在临床上的最早应用就是应用于治疗急性胰腺炎，日本早在 20 世纪 80 年代中期做的一系列有效实验证明了 TI 治疗急性胰腺炎的有效性和安全性。目前很多临床上应用的胰蛋白酶抑制剂都对 AP 有显著的疗效。近年，有人采用生长抑素和尿胰蛋白酶抑制剂联合治疗重症胰腺炎起到比单独使用时好的疗效。2、外科手术中的应用 虽然通过外科手术可以解决很多患者的病痛，但手术尤其是大型的手术后，机体处于一种非生理状态，物质代谢亢进，免疫力下降，同时伴有缺血、缺氧和各种酶、炎性介质、自由基的释放，经常会导致术后器官功能衰竭的发生。近年来，大量的临床研究表明乌司他丁(尿胰蛋白酶抑
19、制剂)可抑制术后机体的过度应激反应，抑制蛋白分解亢进，调节机体炎症介质和体液因子的水平，通过改善微循环和稳定溶酶体膜对肾小球、肾小管功能起保护作用，减少术后并发症。目前，日本在手术后已经广泛使用乌司他丁以预防手术后器官功能衰竭(尤其是肾与肺)和再灌注损伤。3、防治脑水肿 在临床上，脑水肿、脑缺血、蛛网膜下腔 出血后的脑血管痉挛等的治疗都是难题。目前治疗脑水肿的主要药物是甘露醇和激素，两者都有明显的副作用，前者引起心、肾损害，后者引起消化道痉挛。日本学者先后研究发现，UTI 和抑肽酶及 SBTI 可以显著降低实验大鼠的脑含水量。1993 年，酶工程神谷提出 TI 的详细作用机制假设：在脑缺血时，
20、血液及脑组织中缓肽酶(bradykinin，BK)水平提高，激活磷脂酶 A 2 (phospholipase A2)，加速花生四烯酸(arachidonic acid，AA)释放，从而加重脑水肿，有些 TI 如抑肽酶、SBTI 通过抑制 BK 的生成，从而起到改善脑水肿的作用在实验中给大鼠颈内动脉注射BK 或狗脑室灌注 BK 可以诱发脑水肿，脑水肿程度与脑组织 BK 水平呈正相关，为此假设提供了证据。4、抑制肿瘤细胞的侵袭和转移 大多数肿瘤患者死亡的主要原因是恶性肿瘤的侵袭和转移。肿瘤的侵袭和转移机制较复杂，是一个多环节、多步骤的过程，涉及细胞与细胞间，细胞与基质间的作用，以及多种基因改变等过
21、程，其中肿瘤细胞穿透细胞外机制尤其重要。肿瘤细胞对基底膜浸润的三个步骤是：粘附、溶解和转移。其中，溶解主要的原因是肿瘤细胞下方的基底膜被蛋白酶降解。利用可降解细胞外基质的蛋白酶抑制剂来抑制肿瘤的侵袭和转移已经引起人们极大的兴趣，其中胰蛋白酶抑制剂倍受瞩目。研究证明，在人体很多肿瘤细胞上都有 TI 的受体 TI 与受体的结合能够调节蛋白酶的活性，抑制它对基底膜的浸润，阻断肿瘤细胞的转移。Kobayashi 等制备了小鼠 Lewis 肺癌模型，用 UTI(尿胰蛋白酶抑制剂) 进行抗肿瘤治疗。发现 UTI 对原位癌的作用不明显，但可以有效抑制肿瘤细胞的转移。尿胰蛋白酶抑制剂和牛肺胰蛋白酶抑制剂小鼠
22、Lewis 肺癌的转移有明显的抑制作用。虽然蛋白酶抑制剂作为新一代的抗肿瘤药物，目前还处于临床试验阶段，并且还存在许多尚未解决的问题，但是由于其针对特殊的作用靶点，尤其是其较小的药物毒性和联合用药潜能，使其具有巨大的抗肿瘤潜力。5、在妇产科方面的应用 TI 在妇产科方面的应用主要体现在预防早产和治疗不孕两个方面。早产约占所有分娩数的 5%15%。早产是围产儿死亡的重要原因之一，75%以上的围产儿死亡与早产有关。约有 1/4 的存活早产儿会遗留智力障碍或神经系统后遗症。因此，防治早产是降低围产儿死亡率和患病率的关键。分娩前羊水中的胰蛋白酶浓度升高，激活某些蛋白水解酶如 -糜蛋白酶、弹性蛋白酶、组
23、织蛋白酶等，降低胎膜稳固性，软化宫颈。动物实验证实胰蛋白酶抑制剂可阻止早产的胎膜、宫颈在形态、功能上的变化，同时降低羊水及血浆中 IL-1、IL-6、TNF- 的浓度。Kabayashi 实验室检测妊娠羊水中的 UTI 水平，发现 1520 周 UTI 浓度为15022mol/L，3035 周为 12018mol/L，3745 周为058024mol/L，分娩前后为 010003mol/L ；可见 UTI 的浓度与正常妊娠的宫缩情况成反向关系，有利于正常的妊娠和分娩。Matsuda 等通过对43 例早产孕妇的观察，发现 UTI 可以有效延长孕期，降低新生儿的死亡率。研究认为，早产的主要原因是感
24、染了革兰阴性杆菌，引起绒毛膜羊膜炎。UTI 预防早产的作用机制可能是：通过抑制中性粒细胞弹力蛋白酶(PMNE)和IL-1、IL-8 等多种细胞因子发挥其作用。Akutsu 发现中性粒细胞弹力蛋白酶水平与 UTI 的比值是评定破膜时间的可靠指标。Sato 等用基因技术得到 UTI 缺乏的小鼠，发现这种小鼠的卵母细胞无法正常成熟和排出，而且其卵母细胞丘排列紊乱，若是将其卵巢移植到正常的野生小鼠的体内，发现其功能完全恢复正常。由此证明了 UTI 是形成稳定的卵母细胞丘复合体的一个重要的因素。而稳定的卵母细胞丘复合体的形成是卵母细胞成熟和排卵所必需的。酶工程6、抗休克 动物实验表明：存在于人尿中的胰蛋白酶抑制剂乌司他丁有改善循环障碍与代谢异常，抑制内源性休克因子(如心肌抑制因子)，以及增强内源性休克因子的作用。在休克常规治疗的基础上加用乌司他丁，可改善休克时的循环情况，抑制休克的恶性循环，减少器官功能衰竭的发生，为休克的治疗提供有利的支持。7、其他方面的应用 除了上述方面，TI 在减轻肺损伤，治疗肺气肿，治疗肺曲菌病；缓解 ARDS 病人呼衰；抗关节炎、皮肤疾患等方面都有基础和临床研究报道。最新研究还发现在移植胰岛过程中，TI 可以抑制各种丝氨酸的活性，提高移植成功率。这些方面的应用还有待于更大规模的临床研究。
