1、游离氨基酸的测定茚三酮比色法标准曲线绘制1. 实验原理游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在 570nm 下测其含量。因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。2. 仪器与用具100ml 容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；刻度吸管：0.1ml1、1ml2、2ml2、5ml l；沸水浴；具塞刻度试管 20 ml10；分光光度计3. 试剂3.1.1 水合茚三酮 称取 0.6g 重结晶的茚三酮放烧杯中，加入 15ml 正丙醇、30ml 正丁醇、60ml 乙二醇及 9 ml PH4.5
2、4 的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10 天内有效。3.1.2 氨基酸标准液 称取 80烘干的亮氨酸 23.4mg，以 10%的异丙醇溶解定溶至50ml（含氮为 50ug/ ml） ，取此液 5ml，用水定容至 50 ml，此为含氮量 5ug/ ml 工作液。3.1.3 0.1%抗坏血酸 称取 0.1g 抗坏血酸定容 100 ml，随用随配4. 实验方法取 6 支 20ml 试管，按下表加剂：管号试剂1 2 3 4 5 6亮氨酸标准液 (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0无氨蒸馏水 (ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0水合茚三酮 (ml) 3.0 3
3、.0 3.0 3.0 3.0 3.0抗坏血酸 (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1氨基氮量（ug/管 ） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热 15min，取出后立即用冷水摇动冷却，用 60%乙醇定容至 20 ml，摇匀。=570nm 处测定吸光度0 0.025 0.055 0.099 0.146 0.1865. 标准曲线绘制以吸光度为纵坐标，氨基氨 ug 数为横坐标，绘标准曲线如图 1。图 1茚 三 酮 比 色 法 测 定 游 离 氨 基 氮 标 准 曲 线y = 0.0382x - 0.0103R2 = 0.9882-0.0500.050.10.150.20 1 2 3 4 5 6氨 基 氮 （ ug）吸光度A6. 待测样测定取 20ml 试管，取待测液 1ml，加蒸馏水 l ml，水合茚三酮 3.0 ml，坏血酸 0.1ml，混匀，封口。沸水浴加热 1 5 分钟，冷水中摇动冷却，用 60%乙醇定溶至 20ml，摇匀，于 570mn测定吸光度 A。7.计算结果：测得吸光度，由标准曲线得知样液的氨基氮 ug/ ml m，代入公式十算：A=0.0382m-0.0103A 为吸光度，代入公式算得 m（ug/ ml）。
