1、影响限制性内切酶活性的因素包括 DNA 的纯度、缓冲液、温度及酶本身。不同的限制性内切酶对缓冲液中盐浓度的要求各不相同。一般配制高、中、低盐 3 种缓冲液，用于酶反应。 DNA 甲基化，附有蛋白质或高分子量 DNA 胶体溶液太粘稠均会降低内切酶的消化效率。由于在限制性内切酶消化反应中，甘油浓度超过 5（V/V ）会抑制内切酶活性，因此在 20l反应体系中，甘油浓度应少于 ll。用 2 种酶消化 DNA 时，各种酶所需盐浓度相同，则消化可同时进行；若需要的盐浓度不相同，则必须先用低盐浓度的限制性内切酶消化完后，再调整到高盐缓冲系统，加入高盐浓度的限制性内切酶，继续消化。由于 loadingbuf
2、fer 中有高浓度的甘油，因此加入 loadingbuffer 后会是酶失活。酶切实验中的注意事项: 1)反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。 2)反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及 DNA 大分子的完整。 3)反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底4）DNA 或酶切试剂中混有 DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发 DNase 的作用，将 DNA 降解。如果楼主得试剂和步骤是正确，既排除了其他因素（试剂，体系，有没有混匀等） 。因为大多数内切酶失活，都是因为酶蛋白本身结构得不可逆改变，各种亚基团不稳定至分离等（如甘油得浓度增大，温度增大 65 度以上） 。所以，向楼主说得在室温放置一个小时，一般不会失活，只是酶切效率降低而已，但反应还是进行得，这样酶就在消耗，酶本身得活性基团在分离，再拿到 37 度，效率肯定会低，甚至没活性，导致酶切看不到条带（如果你的酶切片断小得话，拿 PAGE 跑，可能会看到带）
