1、CXCL12 促进人胃癌 AGS 细胞体外侵袭及其机制研究【摘要】 目的 研究趋化因子 CXCL12 对人胃癌 AGS 细胞侵袭性的影响。方法 在体外用不同浓度 CXCL12 处理 AGS 细胞后，应用 Transwell 侵袭实验、RTPCR 、明胶酶谱分析法、ELISA 法，观察 CXCL12 对肿瘤体外侵袭能力及金属基质蛋白酶 MMP9 活性和 VEGF 表达的影响。 结果 CXCL12 作用后，人胃癌 AGS 细胞侵袭能力明显增强，并具一定的量效关系；金属基质蛋白酶 MMP9 活性呈剂量依赖性增强，VEGF 的分泌增加。结论 CXCL12 在体外可增加人胃癌 AGS 细胞的体外侵袭性。
2、 【关键词】 趋化因子；CXCL12；胃癌；胃黏膜上皮细胞；金属基质蛋白酶 9ABSTRACT：Objective To study the effects of CXCL12 on the invasion of the human gastric carcinoma cell (AGS cell). Methods AGS cells were pretreated with different concentrations of CXCL12 in vitro, and cell migration assay, RTPCR, zymography and ELISA were used
3、 to observed the effects of CXCL12 on motility, invasion and MMP9 activity and mRNA expression of AGS cells. Results CXCL12 could increase invasion ability of AGS cell in vitro. The activity of MMP9 was increased in a dosedependent manner. The mRNA expression of MMP9 of pretreated AGS cells was upre
4、gulated. Conclusion CXCL12 could increase invasion ability of human gastric carcinoma cells in vitro.KEY WORDS：Chemokine;CXCL12;Gastric cancer;AGS cells；MMP9肿瘤的侵袭是肿瘤转移的重要环节，是肿瘤细胞粘附、酶降解基质、移动、基质内增殖等一系列过程的表现1。本研究体外观察了趋化因子 CXCL12 对肿瘤体外基质金属蛋白酶 MMP9 活性以及VEGF 表达的影响，以探 讨 CXCL12 促进胃癌细胞侵袭转移的作用机制。1 材料和方法11 实验材
5、料CXCL12 购自美国 Sigma 公司；胰蛋白酶和 DMEM 培养基( 高糖)购自 Gibco 公司(USA)；胎牛血清购自杭州四季青公司 (CHINA)；Trizol Reagent 购自 TaKaRa 公司(JAPAN)；MMLV 逆转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo(dT) 、dNTP 混合物购自 Promega 公司(USA)；引物序列由上海 Invitrogen 公司(USA) 合成；Transwell 侵袭小室购自 Costar公司(USA)；人工基质胶(Matrigel)购自 BD 公司(SPAIN)。12 实验方法121 细胞培养人胃癌 AGS 细胞购自武汉大学细胞典藏中心
6、 (CTCC)。AGS 细胞贴壁培养于含 10%胎牛血清、100U/ml 青霉素、100mg/ml 链霉素的DMEM 高糖培养基， 37C、5%CO2 饱和湿度条件下培养。取对数生长期细胞进行实验。按如下分组进行实验：空白对照组、50ng/mlCXCL12 组和 100ng/mlCXCL12 组，每组设置 3 个平行孔。122 Transwell 侵袭小室检测细胞侵袭能力的变化侵袭能力的测定采用 Transwell 侵袭小室：Matrigel 胶(30g/ 孔) 包被聚碳酸酯膜(8m 孔径)内表面，以此膜分隔上、下小室。无血清DMEM 调整细胞浓度 为 1106/ml，在上室中加入 100l
7、细胞悬液，在下室中加入 600l 含不同浓度 CXCL12 的无血清培养液，然后在 37C 的培养箱中孵育 48h，取出滤膜，用 4%的多聚甲醛固定，棉签擦去滤膜上未贴壁的细胞，甲醛固定 5min，HE 染色。400 倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数 5 个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数 3 份样本。123 RNA 提取和逆转录 聚合酶链反应(RTPCR)RNA 提取参照 RNA Trizol 提取试剂盒的操作说明书进行。提取的 RNA 纯度由 A260/A280 比值和 1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取 1g RNA，以 O
8、ligo dT 为引物逆转录成 cDNA。反应体系(20l)：5MMLV buffer 4l，dNTP 10mmol，RNase 20U，MMLV 100U，Oligo dT 20pmol，RNA 1g。逆 转录反应条件：20C 10min，42C 60min，95C 5min。取 2l 的逆转录产物行 PCR 扩增，以 actin作为内参照。MMP9 引物：上游5ATCCAGTTTGGTGTCGCGGAGC3，下游5GAAGGGGAAGACGCACAGCT3；actin 引物：上游5CCTGGCACCCAGCACAAT3,下游5GCCGATCCACACGGAGTACT3。PCR 反应条件：9
9、5C 5min，94C 60s，57C 45s，72C 60s，35 个循环；72C 10min。2%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统扫描对 PCR 产物进行半定量分析，分析结果时以 actin 的产物为内对照，计算 MMP9/actin 比值。124 明胶酶谱 法分析 CXCL12 对基质金属蛋白酶（MMP）活性的影响将对数生长期细胞接种 6 孔培养板，37C、5%CO2 培养 24h 后，改换含不同浓度 CXCL12 的无血清培养液培养；继续培养 24h 后，收集上清液，离心处理后上清液作为测定的样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。制备 10%分离胶(含 0.1%明胶)，5%浓缩胶；样品与缓冲
10、液按21 混匀、加样；10mA 恒流、4C 电泳至分离胶时换成 15mA 恒流；至溴酚蓝刚好到胶底处，停止电泳。分离胶用蒸馏水漂洗 2 次后加酶缓冲液，置 37C 摇床摇 36h；水洗，染色、脱色，观察透明带，用凝胶成像仪和 LABWOR 软件读取透明带并进行定量分析。125 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中 VEGF含量收集各组细胞培养上清，置于-20C 保存待测。ELISA 按试剂盒说明书进行操作。根据试剂盒提供的标准品制作标准曲线。每孔加入100l 细胞培养上清液，让待测抗原与包被的抗体结合，37C 孵育60min。洗板 4 次，每孔加入 100l 生物素标记 抗体，3
11、7C 孵育60min。洗板 4 次，每孔加入辣根 过氧化酶标亲合素 100l，37C 孵育 40min。洗板 4 次，每孔加入 显色剂 100l，37C 避光显色 20min。在 490nm 波长检测吸光度(A)值，通过绘制的标准曲线求出待测样本中 VEGF 浓度(pg/ml)。1.3 统计学分析所有数据均以s 表示，采用 SPSS12.0 统计软件进行单因素方差分析，以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果21 CXCL12 对 AGS 细胞侵袭能力的影响我们采用 Transwell 侵袭小室法检测了 AGS 细胞侵袭能力的变化，结果发现：CXCL12 可明显增强 AGS 细胞的侵袭力
12、。每 200 倍视野计数，空白对照组的穿透数为(465)个， 50ng/ml 和 100ng/ml CXCL12 处理组 AGS 细胞的穿透数分别为(936)个和(1159)个。统计学分析表明，50ng/ml 组和 100ng/ml 组与空白对照组间差异有统计学意义(P均0.05)，表明 CXCL12 能显著增强胃癌 细胞的体外侵袭能力。22 CXCL12 对 AGS 细胞 MMP9 mRNA 表达的影响PCR 反应产 物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示：各实验组均可检测到特异性的 MMP9mRNA 的基因条带；CXCL12 可以上调 AGS 细胞中 MMP9mRNA 的表达水平，结果见图 1。半
13、定量分析结果显示，空白对照组中 MMP9/action 比值为(34.25.6)%；50、100ng/ml CXCL12 处理后， MMP9/action 比值分 别为(52.86.3)%、(67.58.4)%，其表达明显增强，经统计学分析，差异有统计学意义(P均0.05)。图 1 CXCL12 对 AGS 细胞 MMP9 mRNA表达的影响23 CXCL12 对 AGS 细胞 MMP9 活性的影响CXCL12(0、50、 100ng/ml)与人胃癌 AGS 细胞共同培养 48h，收集培养上清液检测金属基质蛋白酶 MMP9 的活性。 结果显示CXCL12 可以增强人胃癌 AGS 细胞 MMP9
14、 的活性（图 2）。空白对照组中，MMP9 相对表达强度为（28.43.0）%，50、100ng/ml CXCL12 处理后， MMP9 相对表达强度分别为（54.75.6）%、（74.46.3）%，与空白组比较差异有显著性意义（P 均0.05）。图 2 CXCL12 对 AGS 细胞 MMP9 活性的影响24 CXCL12 对 AGS 细胞分泌 VEGF 的影响培养的人胃癌 AGS 细胞未受到 CXCL12 刺激时，其细胞培养上清液中 VEGF 的浓度为 (38.316.26)pg/ml；随着 CXCL12 刺激浓度的增加，人胃癌 AGS 细胞分泌 VEGF 浓度也逐渐增高。当以 50ng/
15、ml和 100ng/ml 的 CXCL12 刺激时，VEGF 浓度分别为(152.4512.72)pg/ml 和(223.6315.20)pg/ml ，与空白 对照组相比，差异有统计学意义(P0.05)，见图 3。图 3 不同浓度 CXCL12 对人胃癌 AGS 细胞分泌VEGF(pg/ml)的影响3 讨 论趋化因子 CXCL12 也称为基质细胞衍生因子1(stromal cellderived factor1,SDF1)，属于 类趋化因子亚家族成员。CXCL12 与受体 CXCR4 结合后，介导淋巴细胞的定向迁徙，在机体免疫和炎症反应过程中发挥重要作用2。最近研究发现CXCL12/CXCR4
16、 在肿 瘤的侵袭、转移中发挥重要作用3。温国明等对趋化因子受体 CXCR4 表达与胃癌预后之间的关系进行了研究，结果发现：CXCR4 在胃癌标本中阳性表达率为 41.3%(76/184 例)，说明CXCR4 的表达与胃癌的分化程度、胃癌淋巴结转移相关4。本实验中，我们选择表达 CXCR4 的人胃癌 AGS 细胞作为研究对象，观察 CXCL12 对 AGS 细胞体外侵袭力的影响，结果发现，CXCL12 可明显增强 AGS 细胞的体外侵袭能力。侵袭性与转移性是恶性肿瘤最重要的生物学行为，也是肿瘤病人致死的主要原因3。 肿瘤的侵袭和转移包括细胞粘附、蛋白酶水解组织基质以及细胞迁移等进程。金属蛋白酶(
17、MMPs)等多种蛋白水解酶介导的细胞外基质及基底膜的降解，是肿瘤侵袭转移的一个关键步骤。研究表明57 ，明胶酶在多种恶性肿瘤组织、培养的肿瘤细胞及癌基因转化细胞中活性增强，体外侵袭实验均证实肿瘤细胞的高侵袭能力与明胶酶的活性增强有关，因而被认为可能是肿瘤侵袭、转移过程中的主要蛋白水解酶。本研究中对 AGS 细胞上清液 进行明胶酶谱分析，对照组 AGS 细胞培养上清仅见微弱负染条 带， 说明 AGS 细胞自分泌少量 MMP9，活性较弱，当给予 CXCL12 刺激时，基质金属蛋白酶 MMP9 的活性逐 渐增强。表明 CXCL12 可增加基质金属蛋白酶的表达与分泌，从而促进胃癌肿瘤的侵袭和转移。肿瘤
18、组织的生长及侵袭转移需要新生血管的生成以保证足够的氧供和营养物质供应，而血管生成是一个严格控制的生物学过程，它同肿瘤的生长和转移密切相关。血管内皮细胞生长(VEGF)在血管形成中发挥重要的作用8。我们采用 ELISA 法检测 AGS 细胞培养上清中 VEGF 含量，发现 CXCL12 刺激 AGS 细胞后，可增加 VEGF 的分泌。表明 CXCL12 可使 肿瘤内 VEGF 的生成和分泌增加，促进肿瘤的生长和侵袭。以上的结果说明，CXCL12 可以通过诱导胃癌细胞生成和分泌基质金属蛋白酶 MMP9 和 VEGF，导致肿瘤 细胞侵袭能力的增加，进而导致了胃癌高度侵袭性的生物学行为。【参考文献】1
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