1、蛋白质的定位与蛋白质裂解液的选择：全细胞：NP-40 或 RIPA细胞质（可溶）：Tris-HCl细胞质（细胞骨架）：Tris-Triton细胞膜：NP-40 或 RIPA细胞核：RIPA线粒体：RIPARIPA 裂解液配方1ml RIPA buffer contains 35l proteinase inhibitor and 10l phosphatase inhibitorRIPA buffer 最终浓度1M Tris-HCl (pH7.5) 5 ml 50mMNaCl 0.87g 0.15 MNa-deoxycholale 0.1g （0.1%）0.5M EDTA(pH8.0) 0.8
2、mlNaF 41 mgNonidet P40 1 ml （1%）Aprotinin10g/l 100l 10g/ml加水到 100mlAprotinin 10g/l ；用 10mM HEPES-KOH（PH8.0）溶解，备用。 Nonidet P-40 简称 NP-40，乙基苯基聚乙二醇,常用非离子性去垢剂。 Na-deoxycholale，脱氧胆酸钠，离子型去垢剂。离子型去垢剂主要作用有：裂解细胞；溶解蛋白，尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白，如膜蛋白等；很适合做 WB，但在 Co-IP 中使用，需要谨慎。 亮抑霉肽（Leupeptin）：抑制丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶）和
3、半胱氨酸蛋白酶（包括木瓜蛋白酶和组织蛋白酶 B） 抑肽素 A（Pepstatin A）抑制各种天门冬氨酸蛋白酶，例如组织蛋白酶 D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和 HIV 蛋白酶； 胰凝乳蛋白酶抑制剂（Chymostatin）抑制具有糜蛋白酶类特异性丝氨酸蛋白酶（包括糜蛋白酶、胃促胰酶、组织蛋白酶 G）和大多数丝氨酸蛋白酶（包括组织蛋白酶 B，H，L） 抗木瓜蛋白酶（Antipain ）抑制木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和纤溶酶。 氟化钠抑制酸性磷酸酶 正钒酸钠：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶 （tyrosine phosphatase） 焦磷酸钠 （sodium pyrophosphate）：抑
4、制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶（serinethreonine phosphatase） 。在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步便是蛋白质的提取。蛋白质的提取过程中，我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的，本文总结了常用的蛋白酶抑制剂 PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotinin抑肽酶，Pepstatin 胃蛋白酶抑制剂，EDTA-Na2 等以及磷酸酶抑制剂 NaF 氟化钠，Na3VO4 原矾酸钠 ，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等。对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作
5、液浓度，保存都做了详细的说明。蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶（可逆的地面处理） 。 溶解性：溶于异丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果10mg/ml。在水溶液中不稳定。在 100%异丙醇， +25时稳定至少 9 个月分子量：174.2使用：贮存浓度：200mM，工作浓度： 1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶 B溶解性：高度溶于水（1mg/ml） 。4一周稳定,分成小份冷冻在-20 至少 6 个月分子量：C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:
6、475.6C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度 0.5 ug/ml (1mM)Aprotinin 抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶， 激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子 X。溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，0.1M，pH8.0） 。pH 约 7-8 的溶液在4可保存 1 周，分装保存在-20可至少保存 6 个月。避免反复冻融, pH12.8 的碱性环境可使其灭活。分子量：6,512使用：贮存浓度:1mg/ml, 工作浓度：0.062.0 ug/ml(0.01
7、 0.3 uM)Pepstatin 胃蛋白酶抑制剂特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶，肾素，组织蛋白酶 D，凝乳酶， 许多微生物酸性蛋白酶溶解性：溶于甲醇约 1mg/ml； 可溶于乙醇，过夜溶解可达到 1 mg/ml；在 6 当量乙酸中溶解度为 300ug/ml。4稳定一周，分装储存于-20时可保存 1 个月分子量： 685.9使用：贮存浓度：1mg/ml，使用浓度：0.7 g/ml(1 M)EDTA-Na2特性：金属蛋白酶抑制剂溶解性：溶于水至 0.5M，在 pH8-9 的条件下，4稳定至少 6 个月分子量: 372.24使用：工作浓度：0.20.5 mg/ml(0.51.3 mM)，
8、不需现用现配，在溶液 pH 值调至 8-9 时再加入。磷酸酶抑制剂NaF 氟化钠 溶解性：溶于水分子量： 41.99使用： 贮存液：5M 工作浓度：10-20mMNa3VO4 原矾酸钠 分子量：183.91溶解性：溶于水，我们购买过来的是原矾酸钠.原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用.原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是:100mM 原矾酸钠激活储存液配制(1).取 0.183 克的原矾酸钠溶解于 10ml 的双蒸水中,加酸调节 PH 至 10(颜色变黄)(2).煮至无色(3).室温冷却(4).重调 PH 至 10(5)重复（） （） （） （）直至溶
9、液保持无色，并且稳定于 10,分装 100ul/管,每10ml 裂解液加一管.(终浓度为 1mM),-20 度保存.使用： 贮存液：100mM 工作浓度： 1mMBETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠溶解性：溶于水分子量：306.11使用：贮存液：100mM 工作浓度： 25mMNa2P2O4 焦磷酸钠溶解性：溶于水分子量：265.9贮存液：100mM, 工作浓度： 1-2 mMSDS ，NP-40 ，TritonX-100 这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。SDS 属于离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA 会释放出来，裂解液变得很粘稠。NP-
10、40 是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的 buffer 可以获得胞浆蛋白。TritonX-100 的能力介于 NP40 和 SDS 之间，偏向于 NP40，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS 基本会使蛋白变性失活） 。Brij Buffer I Tris-HCl (1M, pH 7.5) 1 millilitre (ml)EDTA (0.5 M) 0.4 millilitre (ml)NaCl (5M) 3 millilitre (ml)Brji 96 (10%) 8.75 millilitre (ml)NP40 (10%) 1.25 millilitre (ml)ddH2O to 100 millilitre (ml)Total volume 100 millilitre (ml)
