1、羊水细胞培养染色体制备常规一、羊膜腔穿刺的时间及方法：1、羊膜腔穿刺的时间：最理想是在妊娠 1620 周进行羊膜腔穿刺。2、羊膜腔的穿刺方法：1）B 型起声定位穿刺点，预先确定胎盘和胎头部位，尽量避开胎盘附着处进针。2） 、嘱孕妇排尽尿，以使膀胱空虚。3） 、检查穿刺部位的皮肤有无疖肿、皮炎，感染等不适合穿刺的情况。4） 、仰卧手术台上，然后嘱病人翻身数次，以使羊膜腔内脱落的细胞悬浮。5） 、恢复仰卧位后，按常规消毒腹部皮肤，铺上消毒孔巾。6） 、穿刺针通过腹壁、子宫，进入羊膜腔的过程中，术者会体会到三种不同的弹性阻抗性。当估计穿刺针已进入羊膜腔后，轻轻抽出穿刺针针芯，接上无菌注射器。7） 、
2、为了防止穿刺时注射器针头内混有母体细胞，可将先抽出的 12ml 羊水弃去，然后更换注射器再抽取羊水 1520ml，注入无菌、带盖的离心管内，供羊水细胞培养用。8） 、抽出羊水标本立即送至实验室进行培养。二、羊水细胞培养：1、 离心（ 10001500r/min）5 分钟。2、 无菌环境中，吸出上清液留作其它检验用。将剩下的 0.5ml 沉淀物轻轻打均。用无菌滴管吸取沉淀悬液，分别平铺于两个无菌羊水培养瓶内。 3、 吸取 F10 培养液 2.1ml 和小牛血清 0.9ml 于羊水培养瓶内，轻轻摇匀，塞紧瓶塞放入 37C 培养箱内静置培养。 4、 换液，于培养 67 天，将羊水培养瓶置接种箱内，吸
3、出（倒出）瓶内培养液，加入新鲜 F10 培养液 2.1ml 和小牛血清 0.9ml，塞紧瓶塞。 5、 倒置显微镜下观察细胞生长情况。如已贴壁生长，以后每天置倒置显微镜下观察一次。6、 当羊水瓶瓶壁布满圆形细胞或出现几个小岛布满许多圆形细胞。每个圆形细胞饱满，边缘清晰，胞核清楚，内含丝状物。细胞肿胀似阿米巴原虫伸出的伪足，象要破裂似的。有的圆形细胞透亮，成双成对。此时羊水培养的细胞可以收获。一般 912 天可以收获。收获前视细胞生长情况更换新鲜培养液。7、 于培养终止前 46 小时，每个培养瓶中加入秋水仙素，最终浓度为 23ug/ml 放入温箱继续培养。三、制片：1、 细胞收获：将培养液移至离心
4、管内，加 EDTA-胰酶消化液 2ml，置 37 C 恒温箱中5 分钟，用滴管吸打 34 次，然后把消化液移到离心管中, 再用 0.85% NaCl 冲冼培养瓶内残留细胞,合并到离心管中。2、 离心（10001500r/min）67 分钟，弃去上清液，留细胞沉淀 0.20.3 ml 加预温至 370C 低渗液(0.4% 枸橼酸钠与 0.4%KCI 1:1) 5 滴以手指轻轻弹起或气泡冲匀加至 5ml ,370C 低渗 5 分钟。3、 预固定，加固定液(甲醇:冰醋酸为 3:1) 7 滴，轻轻用气泡冲匀，离心（10001500r/min）5 分钟。4、 固定，弃去上清液，加固定液 4ml 混匀，固
5、定 40 分钟，离心弃去上清液；第二次固定，加固定液 2ml，轻轻以气泡冲匀，固定 20 分钟。5、 滴片，离心（10001500r/min ）5 分钟，弃去上清液，加新鲜固定液 34 滴，气泡冲匀，滴片 3 张。标本放 600C 烤箱,烤 1624 小时，即可进行显带。四、影响培养成功的关键问题：1、培养基 PH 值以 6.86.9 为宜，PH 值低于 6.4 或高于 7.0，细胞不易贴壁生长。2、小牛血清建议用混合小牛血清，应在零下 20 度低温保存。3、培养过程必须严格遵守无菌操作规程，防止培养物被污染。4、每一步操作都要轻，离心时间不能太长，速度不能太快。5、直观羊水中混有血液的标本可提前一天换液。五、禁忌症：1、 孕周小于 14 周或大于 24 周的孕妇。2、 有稽留流产或先兆流产未治愈的孕妇。3、 有习惯性流产史孕妇的妊娠危险期。4、 有盆腔或宫腔感染的孕妇。5、 中央性前置胎盘或前置、低置胎盘有出血现象的孕妇。
