1、石斛兰细胞分裂素氧化酶基因 DSCKX1 的功能特性杨淑华，余高和高崇金（新加坡大学科学学院生物系植物生长与发育实验室 新加坡 119260 新加坡 通讯作者 email ：dbsgohcjnus.edu.sg）发送 2001 12 16 最终接收于 2002 5 24关键词：细胞分裂素 细胞分裂素氧化酶 石斛兰 DSCKX1 幼芽/根生长摘要细胞分裂素氧化酶在细胞分裂素的调控过程中起重要作用。通过 mRNA差显技术，在含 BA的培养基中，我们从索尼亚石斛兰幼苗茎尖中克隆出一种新的假定的细胞分裂素氧化酶，DSCKX1（索尼亚石斛兰细胞分裂素氧化酶） 。该 DSCKX1基因似乎有三种可选择的剪接
2、形式，并且细胞分裂素通过一种具有组织特异性的方式诱导 DSCKX1的表达。在 DSCKX1转基因超表达的兰科植物中，细胞分裂素氧化酶活性水平升高伴随着细胞分裂素含量降低。这在离体培养中表现为根密长而芽生长缓慢，并且降低愈伤组织的生芽能力。相反的，与野生型植物相比，转反义基因植物在内源细胞分裂素含量较高的情况下幼芽增殖迅速而根生长受到抑制。因此 DSCKX1似乎在细胞分裂素代谢和兰花的相关生长发育中发挥重要作用。缩写词：BA 苯甲酸嘌呤 CaMV 花椰菜病毒 CKX 细胞分裂素氧化酶 DIG 异羟基洋地黄毒甘元 FAD 黄素腺嘌呤二核苷酸 iP 异戊烯酰嘌呤 iPA 异戊烯酰腺苷 ZR 玉米素核
3、糖甘前言细胞分裂素是植物众多生长发育过程中的一种重要植物激素。这些过程包括细胞分裂、芽的增殖、侧芽生长、光合作用、叶绿体发育和延缓叶片衰老(Skoog and Armstrong, 1970; Mok, 1994)。因此，了解植物细胞中细胞分裂素的生物合成和代谢，对更好的理解调控激素水平平衡的途径及其对植物生长发育的相关影响很有必要。尽管关于细胞分裂素稳态调控的分子机制尚未完全阐明，但是近年来大量的相关工作为解决该问题开辟了可能性。最近已在拟南芥中发现并鉴定出几个编码腺苷酸异戊烯转移酶（细胞分裂素合成酶）的基因(Kakimoto, 2001;Takei et al., 2001)。并且已经从拟
4、南芥和小立碗藓中分离出一些编码嘌呤代谢酶（在细胞分裂素的互变异构中起作用）的基因(Moffatt et al.,1992; Schnorr et al., 1996; von Schwartzenberg et al., 1998)。有几个与细胞分裂素代谢相关的过程已被确定，主要包括特定葡糖基转移酶介导的 N -糖基和 O -糖基转移途径和细胞分裂素氧化酶（CKX）的 N6 -侧链裂解途径(Letham and Palni, 1983; Brzobohat et al., 1994) 。目前已分别从艾叶、菜豆和玉米中克隆出三个编码 O-木糖基转移酶、O-葡糖基转移酶和顺式玉米素 O-葡糖基转移
5、酶的基因(Martin et al., 1999a, 1999b; 2001)。细胞分裂素氧化酶，是唯一已知的作用于自然发生的细胞分裂素失活的植物酶(Hare and van Staden, 1994; Jones and Schreiber,1997)，其被认为是在植物发育过程中内源性细胞分裂素水平的调控和分布的关键点。目前已经从玉米中分离出第一细胞分裂素氧化酶基因（CKX） ，它编码的糖基化蛋白含有一个共同的 FAD结合序列(Houba-Hrin et al., 1999; Morris et al., 1999)。随后，在拟南芥也中发现了几个同源基因(Bilyeu et al., 200
6、1)。CKX在苔藓原生质体(Houba-Hrin et al., 1999)和酵母(Morris et al., 1999)中表达所得的重组蛋白，其本质是包含一个共价结合黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的黄素蛋白，这与玉米的内源性 CKX是相同的。最近，拟南芥 CKX基因在转基因烟草植株中的异位表达表明，细胞分裂素缺陷型植株会出现芽发育不良而根系发达的现象(Werner et al.,2001)。尽管在过去几年里取得了不小进展，但 CKX在植物生长发育过程中具体的生理功能和调节机制尚未完全研究清楚。兰科是开花植物中最大的一个家族，兰花属于兰科的一种。尽管在兰科植物生长发育的调控过程中，与细胞分裂素
7、生理作用相关的信息，包括细胞分裂素的分子机制还知之甚少，但是体外组织快繁的最新研究进展(Lakshmanan et al., 1995)和兰花基因转化体系的改进(Belarmino and Mii, 2000; Yu et al., 2000, 2001)都将对这一研究起到积极的促进作用。为了研究苄氨基嘌呤（BA）诱导基因差异表达，我们通过 mRNA差异显示分析方法(Liang and Pardee, 1992)，分离得到一个基因，该基因在转录水平显著增加茎尖对BA的敏感度，该基因编码一个假定的细胞分裂素氧化酶，称之为 DSCKX1 (Dendrobium Sonia Cytokinin Ox
8、idase gene)。通过检测表达方式和分析 DSCKX1基因水平的改变对兰花转基因植株稳定性的影响，我们得出此兰花酶的功能特性。材料和方法植物材料和生长条件选择 D. Sonia石斛（由凯撒石斛和富江德雷克石斛杂交而来）作为研究材料。用幼嫩的花芽作为外植体，离体培养在改良 KC液体培养基(Knudson, 1946)中，培养基中添加 2% w/v蔗糖、15% v/v 椰子汁，加或不加 25 M BA。差异显示分析通过前面描述的方法，从植物各种组织中提取出总 RNA (Yu and Goh, 2000a,b)。根据制造商提供的说明，差异显示分析采用 TM差异显示试剂盒（Clontech 公司
9、） 。在有无 25 M BA条件下的茎尖（6 周龄）RNA 总量被用于差异显示分析。差异显示条带的克隆方法如前所述(Yu and Goh, 2000a)。差异表达克隆（ba91）的测序，和作为探针筛选 cDNA文库将在下文表述。cDNA 文库的构建及筛选采用 Poly (A)快速提取 mRNA试剂盒（Strategene 公司）从经 BA处理的茎尖（6周龄）中提取出 Poly (A+) RNA。然后根据制造商提供的说明，利用 ZAP-cDNA Gigapack III Gold克隆试剂盒(Strategene 公司) 构建了一个 cDNA文库。该文库（约 600,000平板）由 Digoxig
10、enin(DIG)标记 ba91基因探针低严格筛选得到。D. Sonia 石斛细胞分裂素氧化酶基因组序列的分离通过改良的 CTAB法(Carlson et al., 1991)从 D. Sonia石斛的叶片中提取基因组 DNA。通过 PCR扩增 DSCKX1基因组序列。两个扩增引物分别是从 DSCKX1 cDNA两端克隆的到的 5-ACC TTC TAG CTA CTC TCT TTG CCG TCA-3和 5-GAT TAG TGA TCA GAG AGA CAA AGC TC-3引物。5端快速扩增 cDNA 法(RACE)根据提供的说明协议，我们利用 SMARTTM RACE cDNA扩增
11、试剂盒（Clontech 公司）从经 BA处理的茎尖中提取得到总 RNA，用于 5-RACE。5-RACE PCR 是先后与两个反向 DSCKX1基因特异性引物 GSP1(5-GCT CTT TAA GCT GTG GTT CCA TAA GCA-3)和GSP2(5-TGA GTT TCC ATC CTT CCC CTT CAG CTT-3)进行嵌套的扩增技术。随后扩增片段进行分离，克隆到 pGEM - T Easy载体并测序。DNA 和 RNA 凝胶印迹分析基因组 DNA（上样量 10g）经 1琼脂糖凝胶电泳，涂抹在带正电荷的尼龙膜上。从 DSCKX1全基因组得到的 DIG标记基因探针用于过
12、夜杂交。然后在 42下保存在DIG-High Prime 标记试剂盒(Roche Diagnostics 公司)的 DIG Easy Hyb 缓冲液(Roche Diagnostics公司)中。在 RNA凝胶电泳前，20 g 的总 RNA要先用乙二醛变性。RNA 在 DIG Easy Hyb 缓冲液(Roche Diagnostics 公司)中进行过夜杂交。若用 DIG标记 RNA探针应在 68下保存，若用 DIG标记 DNA探针则应在 50下保存。DIG 标记 DSCKX1 RNA探针用 DIG RNA标记试剂盒(Roche Diagnostics 公司)体外转录合成。根据制造商的指示说明，
13、利用 CDP-star(Roche Diagnostics公司)进行化学荧光标记法检测。抗体制备及免疫分析DSCKX基因部分片段以 pBlue-script质粒为模板利用基因特异性引物 5-CGG GAT CCT GAA TTG GAT ATC GTT AC-3进行 PCR扩增。该质粒包含 DSCKX1 cDNA全基因组（被称为 pB-DSCKX1） ，该引物有一个 BamH酶切位点和 T7引物延伸位点。PCR 最终产物经 BamH和 Kpn酶切，插入组氨酸标记表达载体 pRSETB(Invitrogen公司)，从而建立 pRSET-DSCKX质粒。根据生产商的说明诱导蛋白合成。该截断蛋白最初
14、由TALON金属亲和树脂(Clontech 公司)纯化，并进一步经 15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。用分离得到的蛋白免疫家兔，第一次注射 100 g蛋白，以后一周注射四次，每次 50 g。用于免疫印迹分析的蛋白质样品经10%SDS-聚聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)硝酸纤维素膜(Bio-Rad公司)上。用1:5,000稀释倍数的抗体孵育印记。免疫检测使用酶连二抗（辣根过氧化物酶IgG抗体H+L）和超信号West Pico化学发光系统(Pierce公司)。细胞分裂素氧化酶活性分析利用 Libreros - Minotta和蒂普顿（1995）方法测定该 CKX活性。
15、蛋白质浓度测定使用 Bradford法（1976） ，检测试剂盒（Bio-Rad 公司）以牛血清白蛋白为标准蛋白。对 Banowetz（1992）法的改进实现了细胞分裂素的提取和量化。植株在液氮中冷冻保存，用 100甲醇提取细胞分裂素。细胞分裂素的纯化用 C18 SepPak(Waters Associates)和反相高效液相色谱法(Trione et al.,1987)。反相高效液相色谱法用1Luna 5 C18柱(150 4.6 mm,Phonemenex 公司)。细胞分裂素的量化使用单克隆抗体 iPA免疫测定方法及 ZRusing异戊烯腺苷和玉米素核苷检测试剂盒（Sigma 公司） 。对
16、三个独立样品进行分析，每一次高效液相色谱分析都要进行三个重复酶联免疫吸附试验。构建用于转化的重组 DNA构建 DSCKX1重组质粒，以 pB-DSCKX1为模板，T3 和 T7 为引物，对 DSCKX1基因进行 PCR扩增。将扩增的 DNA片段克隆到 pGEM-T Easy载体上，从而引入一个新的位于 DSCKX1基因 C-端的 SacI识别位点。重组质粒随后经 XbaI和 SacI 酶切，克隆到pBI121二元载体(Clontech 公司)下游花椰菜花叶病毒（CaMV）35S 启动子的XbaI/SacI位点上。将 -葡萄糖醛酸酶基因替换为 P-DSCKX1-S。DSCKX1 反义质粒的构建，
17、DSCKX1 片段可直接以 pB-DSCKX1为模板由 PCR扩增得到。所用引物为 T3引物和含有 XbaI位点的基因特异性引物（5-CGA GAT CTG ATT AGT GAT CAG AGA GAC-3） 。扩增片段经 XbaI和 SmaI 酶切后，插入到 pBI121载体 GUS基因上游的 XbaI和 SmaI位点，从而构建 P-DSCKX1-AS结构。兰花转型石斛兰花外植体转化和再生描述(Yu et al., 2001)。外植体在改性的KC培养基中体外培养培养基含200 mg/L卡那霉素和羧苄青霉素，在25 C条件下,光照16小时。对于转基因植株的再生芽意义分析，将来自于转基因植株和
18、野生型植株的愈伤组织(4 4 1 mm 3).在固体苄氨基嘌呤-free KC培养基上进行培养, 4个星期后，计算再生芽个数。对于在体外，培养在含有10微升苄氨基嘌呤的KC培养基中的转基因植株与野生型植株的愈伤组织(3 3 1 mm 3)的研究。6周后进行观察。结果分离克隆对苄氨基嘌呤的差异性表达mRNA差异显示(Liang and Pardee, 1992)在存在苄氨基嘌呤的情况下的对来自protocorm-like bod-ies (PLBs, 6-week old) of Dendrobium Sonia茎类的表达进行比较。一个扩增带（91d）用引物的大小约 1200 bp的 5 ATT
19、AACCCTCACTAAATGCTGGGTG - 3 a和 5 - CATTATGCTGAGTGATATC（T） 9GC 3仅仅出现在用 BA处理过的茎尖上。该表达模式进一步证实了杂交分析（数据未显示） 。为了进一步研究该基因的功能对兰花生长的影响，使用 cDNA文库的筛选的 ba91片段作出植株根尖培养提供 25 M BA.从 60W个独立片段中筛选分离出 20个阳性克隆位。这些克隆只是一组基因部分序列的分析结果。因此，最长的一次，指定DSCKX1(accession no. AJ294542)，被选定为进一步的研究。DSCKX1 基因是含有一个开放阅读框，编码 536个氨基酸的蛋白质，预计
20、分子质量为 60.4kDa和等电点为6.24。 假定一个信号肽序列（31 个氨基酸）和一个潜在的 N -糖基化位分别位于在 N -末端和氨基酸位置 330-332。此外，162 个氨基酸家庭 odomain区域，一个假定基因会结合此基因序列，图中区域内从位置 66至 228（图 1）。在推导的氨基酸比较序列的 DSCKX1与其他细胞分裂素氧化酶基因（图 1）表明，DSCKX1 与玉米 CKX1、拟南芥CKXs和水稻 CKX表现出很高的同源性。DSCKX1 基因组组织DSCKX1 基因组结构的确定通过相应的基因组 DNA扩增 片段，此片段完全覆盖 DSCKX1基因，利用基因特异性引物侧翼基因，比
21、较基因组 DNA和 cDNA 序列显示，DSCKX1 由四个项组成，而且外显子、内含子交界处序列的 RNA剪接符合 GA-AG规则(Breathnach et al., 1978)。为了研究该基因组组织在兰花的 DSCKX1基因组基因，我们进行 的 DNA探针与fulllength DSCKX1凝胶印迹。如图 2a所示，只一个主要的波段观察到的所有的基因组 DNA，除了由 SacII在 DSCKX1基因识别，表明 DSCKX1作为一个单拷贝基因的低拷贝数基因家族成员的存在于兰花基因组中。DSCKX1 基因的选择性剪接外显子内含子特异性寡核苷酸探针，采用 Northern杂交分析，以研究基因选择
22、性剪接的 DSCKX1。共生成三个外显子，2.0,1.7 和 1.3kb，同时检测的全长 cDNA，得到DSCKX1的 第二，三和四外显子探针(Fig-re2b,lane1) 。由于 Southern与探针杂交杂交全长 DCSKX1发现只有一个单波段（图 2a） ，我们的结果表明，DSCKX1 可能有三个来自同一初级转录剪接形式。此外，单一 2.0 kb的检测由 intronI特异性探针带（图2b，泳道 2）表示，可能会在一个包括内含子剪接形式。这项试验证实了我们的 cDNA文库筛选的结果，其中克隆含有内含子的（2.0 kb的）的确是在植株茎尖的 cDNA文库中孤立的存在的.cDNA 文库筛选
23、的结果证实了这点，其中含有内含子 的克隆（2.0 kb的）的确是从在有 BA存在的植株茎尖 cDNA文库中分离的。比较用全长 DSCKX1探针检测到的信号（图 2b，泳道 1），1.7 和 2.0 kb的 mRNA转录物的积累用外显子 I探针作 Northern blot分析发现（图 2b，泳道 3），清楚地表明外显子 I被跳过了 DSCKX1转录重要的一部分（1.3kb 转录）。DSCKX1转录剪接构成的区别可以用 5-RACE做进一步的鉴定。把 5-RACE产物作凝胶分析发现三个片段 1.13，0.86 和 0.49kb（图 4c），符合 2.0 kb、1.7 kb、1.3 KB信号各自的
24、 Northern blot分析结果。序列分析表明，1.13 kb的 PCR扩增片段的准确地跟 DSCKX1的外显子与内含子 I+II的保留部分一致（图 2c）。除了内含子 I序列的缺失部分以外，局部的 1.13 kb片段中发现与 0.86 kb相同的片段。该 0.49kb 5-RACE产物不同于来自部分外显子 I序列缺失的 0.86 kb 片段。 因此，出现了 5-RACE 分析认为 DSCKX1基因转录变异是由外显子 I和内含子 I序列的变体的组合产生。Northern和 5-RACE的分析还显示，初级转录的 DSCKX1拼接是在存在 BA的茎尖形成1.7 kb的 mRNA转录中实现的（图
25、 2b和 c）。这三个不同的转录水平作进一步检测处理受到不同细胞分裂素的组织表明 1.7kb mRNA转录积累主要存在所有这些检查过的组织中（数据未显示）。因此，DSCKX1 基因后续表征的重点是主要的 1.7kb mRNA转录。DSCKX1 表达的特征DSCKX1表达响应细胞分裂素的机理通过 RNA凝胶 blot分析进行了研究。当 BA存在时（25m），苗中的 DSCKX1转录在二天后处理检测中首次发现，4 天后达到最高水平，此后维持在较高水平（图 3a）。DSCKX1 基因表达的剂量反应显示，当受到剂量为230 M 的 BA 时，DSCKX1 转录积累可以检出（图 3b）。在不同细胞分裂素
26、中，DSCKX1表达量都受到 BA的强烈诱导，中度至弱受 isopenteny ladenine（IP），isopenteny ladenosine（iPA），玉米素核苷，激动和玉米素的诱导，但不受腺嘌呤的影响（图 3c）。进一步的检测表明，DSCKX1 不会由其他植物激素，如赤霉素，脱落酸，乙烯（ACC）和生长素的诱导（2，4- D）（数据未显示）。DSCKX1受到 BA影响的组织特异性表达也作了试验（图 3d）。在没有 BA控制的植株中，包括根组织，茎尖，茎，叶中都没有检出转录，而在 BA存在时（10M），DSCKX1在根中表达，在茎尖中则是相对较低的表达水平，在叶和茎中表达量极少。观察到
27、的 DSCKX1蛋白表达模式与其 mRNA表达模式相同（图 3）。为了评估 DSCKX1在兰花生长中所起到的功能作用，在 CaMV 35S启动子的控制下，通过农杆菌介导的转化，我们作了正转化和反义转化的兰科转基因植株(35S:DSCKX1se and 35S:DSCKX1as transformants)。一共有 18个独立的35S:DSCKX1se转化株。由于在试管中授粉的石斛兰杂合体的 T2子代的再生不成功，而且也没有在大多数独立的转基因植株中找到最相适应的表型，T1 初级转化还要作进一步分析，以评估转基因的影响（Yu et al.,2000）。Southern杂交分析显示，S7，S13
28、中，S15 和 S21的转基因株系似乎有一个DSCKX1基因的一个单独拷贝（未显示数据）。该基因表达用独立转基因株系进行了RNA凝胶印迹分析。正如图 4a所示，DSCKX1 表达没有在分离的野生型中观察到，然而高水平的转基因表达在那些独立转化测试中被探测到（图 4b）。利用 western杂交分析，即抗体特异性结合 DSCKX1蛋白的缩短形式，DSCKX1 蛋白质积累被证实（图 4c）。正如预期，截断形式的分析，提出了一种抗体预期，比较其野生型植株，CKX 在35S:DSCKX1se 转化株的含量升高 2 - 4倍，而所有检测水平的细胞分裂素都降低（表 1）。在 iP转化型植株的细胞分裂素含量
29、水平只有野生植物的细胞分裂素含量的四分之一到一半，且 zeatin转化型植株细胞细胞分裂素含量也相对减少。在添加 PLBs的固体 KC培养基（34 mm）内培养 10周后观察到放射性 S35标记DSCKX1se的小植株平均叶片数量是野生型植物叶片的 75%，而根的生长就伸长率及数量而言转基因植物有更明显的优势（图 6a） 。平均来说，放射性 S35标记 DSCKX1se的小植株每长 3.7 0.8 cm生长 8.5 2.1 (n = 15)条根相较于野生型植株每长为2.3 0.8 cm生长 5.1 0.9 (n = 15)条根。 此外 DSCKX1 基因存在会显著影响体外愈伤组织幼芽的形成能力
30、。野生型在培养基内幼芽原基从愈伤组织出现大约需两周时间。相对于放射性 S35标记 DSCKX1se的小植株培养 3周后幼芽并不能全部再生。野生型植株在培养 4周后其幼芽再生能力超过转基因植株幼芽再生能力两倍（图 6b） 。这些结果表明内生细胞分裂素含量在幼芽的再生能力和根的形态发生的发育过程中起到重要作用。反义抑制 DSCKX1 mRNA 的表达为了更深入去阐明 DSCKX1基因的生物学功能。我们通过反义技术抑制 DSCKX1 基因的表达。在 放射性 S35标记的 DSCKX1酶植株中有 23株兰科植物在花叶病毒 35S启动子作用下表达了 DSCKX1 反义基因，其中有 9株转基因植株幼芽/根
31、的发育状况相似。选择由三种这些独立的基因组长散布序列去分析 DSCKX1 转录过程中抑制作用。图 4d显示，DSCKX1 mRNA 在叶子上的表达水平相对减少。在添加 10umBA的 KC培养基中培养三种反义转基因序列植株，在序列 AS6中有微弱的抑制作用。通过检测三种反转录转基因序列的积累量。表明了反转录 DSCKX1 的存在可能会降低内源 DSCKX1 的转录。通过对反转录转基因植物进行 DNA凝胶电泳分析反转录中有 3-4个拷贝可以融入到兰科植物基因组中并成为独立的转化株（数据未显示） 。补充检测小植物叶片上酶蛋白水平可通过测量CKX活力和蛋白质凝胶电泳分析。在所有被检测的序列植株中DS
32、CKX1 多肽水平都或多或少下降（图4d,e）.这是由于CKX活力都相对减少（图5a） 。反转录转基因植物幼芽与野生型幼芽维持着相似的表型（图5a） 。iP型细胞分裂素浓度在反义序列相对增加与在此线上CKX活力相对降低成反比（表5a,b）。反义转化株幼芽与野生型植株保留着相似的表型（图6a）。在BA培养基培养情况下，转基因植物遇上组织分化比野生型愈伤组织更多了PLBs.在放射性S 35标记的DSCKX1 转基因植物愈伤组织（3 3 1 mm 3）中PLBs的量为11.3 2.7.相较于野生型只有5.1 1.9.相反转基因植物跟的发育被阻止被严重抑制。讨论鉴定一种新型兰科植物细胞分裂素氧化酶在这
33、项研究中我们分离并描述可细胞分裂素氧化酶基因 DSCKX1 ，其影响了顶芽的分化及其表达水平。Sonia 胚芽可以在 BA存在下培养，可预测兰科植物 DSCKX1 蛋白与玉米、水稻。和拟南芥 CKX在氨基酸序列表现出高一致性的同源性。如其它依赖 FAD的氧化酶( Mushegian and Koonin, 1995),DSCKX1 有一个 FAD键结合域,可保护其与以GHS为主的形式存在。这可推定 FAD键结合域附近有组氨酸残留物中有许多黄素蛋白氧化还原酶(Houba-Hrin et al., 1999)。图 6显示 DSCKX1是一种依赖性 FAD氧化酶既是一种黄素蛋白。添加 FAD共价键作
34、为辅助因子(Morriset al., 1999; Bilyeu et al., 2001; Galuszka et al., 2001).DSCKX1 转录可能性选择性剪接机制我们提出 DSCKX1转录可能性选择性剪接机制，其拼接位点的选择受多种因素的影响，包含识别内含子与外显子中有效的 AU/GC的转变；拼接位点与交叉点两者的重要性。在富集 AU序列上游有 3端剪接位点，且在富集 GC序列在外显子内(Simpson and Filipowicz, 1996; Lorkovic et al.,2000)。在 DSCKX1基因中，尽管 AU/GC在内含子及其周围外显子存在发生了剧烈的转变，它可
35、能不会导致第一个内含子完整的剪接。由于在 3剪接位点上游富集 U序列的存在对内含子形成过程与拼接位点的选择是有效率的重要性(Lou et al., 1993)。内含子的 3拼接位点上游存在了相对大量的 GC序列会使 DSCKX1内含子 1接受子拼接位点很难识别。这会导致 DSCKX1最初转录存在包括在内的很多变体。DSCKX1前 mRNA残余物的可接受剪接的有效功能有待研究。在所有组织中成熟mRNA转录与其化两中转录产物起了支配作用这是非常显著的。此外，三种转录产物在相似的不通细胞分裂素具有相应的表达这表明了 DSCKX1基因的选择性剪接的模型是基本性和稳定性。细胞分裂素氧化酶 DSCKX1
36、活力规律在一些系统中通过细胞分裂素、外源细胞分裂素的添加诱导 CKX活力的增强(Chatfieldand Armstrong, 1986; Kamnek and Armstrong, 1990;Motyka and Kamnek, 1990)。此外，CKX 活力的增强也可通过内源性细胞分裂素过量产生通过两种自然发生启动子与条件性启动子对细胞分裂素生物合成基因 IPT的转变(Zhang et al., 1995；Motyka et al., 1996)。这些结果说明基质中 CKX活力对植物细胞激素平衡起了作用(Zazmalov et al., 1999)。因为增强了 CKX活力对 RNA与蛋白质
37、易起到抑制作用。这可能是在转录或翻译过程中的相应作用(Chatfield and Armstrong, 1986)。结果显示出外源细胞分裂素可导致 DSCKX1 mRNA转录产物的积累并与表达 DSCKX1的蛋白增加相一致。演示了此反应至少个别规律性的转录过程。细胞分裂素氧化酶显示出植物生长素与激素稳定性的相互作用。植物生长素浓度的增加通过体外添加或转基因植物组织体内产生导致内源细胞分裂素浓度的下降。这至少经由提升 CKX活力调停(Jones and Schreiber, 1997).我们现有研究表明植物生长激素(2, 4-D)对转基因 DSCKX1兰科植物转录水平及其相应蛋白质的产生毫无刺激
38、作用。细胞分裂素生长素浓度的增加或外源性应用(Palni et al., 1988; Zhang et al.,，1995)或在转基因植物组织产生内源性（Eklof et al.，1997）导致了细胞分裂素的水平大幅下降，这至少有部分介导的 CKX活性（Jones and Schreiber，1997） 。我们目前的研究清楚表明，生长素（2,4 - D）对 DSCKX1转录水平无刺激作用，同样在蛋白质水平上也没有刺激作用。这可能是因为生长素的调节可能直接对通过生物合成途径的细胞分裂素细胞分裂素的水平的平衡起调节作用。DSCKX1 基因对兰花发展的影响细胞分裂素关系到很多细胞活动，包括包括细胞分
39、裂和细胞培养分化(Redig et al., 1996; Zaz-malov et al., 1996)，在组织形态发生反应变化(Centeno et al.,1996)，和器官发育(Auer and Cohen, 1993)。探讨生物细胞分裂素和 CKX对兰花的作用，我们对纳入样本内转基因高表达或低表达组成的 DSCKX1转基因植株表现出增强的兰科植物 CKX活动和细胞分裂素含量相应减少，表明过量 DSCKX1蛋白是一种功能性酶的细胞分裂素。通过对植株重量，叶片大小，以及拍摄的愈伤组织的增殖观察发现 35S：DSCKX1 导致细胞分裂素转化水平下降 。此外，这些转基因植物产生的根较野生型植物
40、长。这些结果和沃纳等人的研究是一致.（2001）其中转基因烟草基因过表达拟南芥 CKX 显示的根系统生长。与此相反，反义 DSCKX1 与 DSCKX1的转基因植物水平降低表现为根系生长减少和愈伤组织的形成增加 ，用细胞分裂素设计并培育高产转基因植物 (Medford et al., 1989)，和细胞分裂素过量生产突变(Chaudhury et al., 1993)和 SPS (Tantikanjana et al., 2001)。生长素的平衡和 细胞分裂素可能对植株形态发挥了重大作用，具有较高的细胞分裂素，有利于芽的形成， 和较高的生长素对根的形成(Skoog and Miller, 19
41、57)。因此，DSCKX1 表型植物有可能是由于生长素对细胞分裂素相对比值在细胞分裂素水平的变化。我们的研究表明，细胞分裂素的水平对细胞分化和植物生长起着重要的作用，至少部分兰花是由 CKX负责的。致谢我们感谢李兰小姐在植物组织培养上的帮助。 新加坡国立大学的研究生奖学金对S.H. Yang 和 H. Yu 的支持。参考文献Auer, C.A. and Cohen, J.D. 1993. Identification of a benzyladenine disaccharide conjugate produced during shoot organogenesis in Petunia
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