1、Rapid Purification of High-activity Taq DNA Polymerase本次试验历时六天，分为准备工作（两天） ，酶的诱导表达（一天） ，酶的提取（一天） ，酶的透析以及酶的保存（两天） 。下面按时间顺序叙述。第一天 准备工作（1）清洗器皿。100ml 量筒：34 个1000ml 量筒：12 个500ml 量筒：23 个250ml 量筒：1 个（没有亦可）1000ml 烧杯：2 个小烧杯：2 个500ml 三角瓶：1 个150ml 三角瓶：23 个500ml 离心管：4 个250ml 离心管：2or4 个50ml 离心管：12or6 个10ml 移液管：56
2、 个药勺：34 个透析袋+超纯水（灭菌）透析夹+超纯水（灭菌）细菌滤+滤膜（灭菌，切勿烤干！）枪头（1ml12 盒，0.2ml2 盒） 小管（1.5ml1 瓶，灭菌）定性滤纸：两包新的 10ml 离心管：灭菌，保存酶用。磁转子：蒸馏水洗，不必灭菌。同时准备一大瓶超纯水备用。Note：（一）整个清洗过程都要戴手套（干燥后操作要戴 PE 手套） 。（二）器皿最后都要用超纯水润洗，倒放在滤纸上干燥。包上牛皮纸灭菌。（三）离心管干燥后封口灭菌。（四）药勺用盐酸处理除去污渍锈斑，灭菌。（2）配 LB 培养基。 （按照分子克隆实验指南配方） 2L 灭菌。预备明晚摇菌。（3）菌种活化，划单斑。取 98.11
3、 的 DJP 菌种划单斑， 37培养，预备明晚摇菌。Note：提取 Taq 酶每次只用上次保存的菌种，每次摇菌后都要保存菌种！PROCEDURAL EXPLANATION：作蛋白表达的细菌和感受态细菌都要经过转瓶活化过程。第二天 准备工作（1）将昨晚划的平板放在 4预备晚上摇菌。（2）配溶液 Buffer A，Lysis Buffer，Storage Buffer 并灭菌。Buffer A：50mM TrisHCl pH7.950mM Dextrose1mM EDTAK +配法：（FOR 400ml induce PreLysis Buffer ）1M TrisHCl（pH7.9） 20ml0
4、.5M EDTAK +（pH7.9） 0.8mlDextrose 3.6g加超纯水至 390ml，pH 计调至 7.9，定容至 400ml。Note：（一）pH 值要在 7.9 以上，7.910 以下。 （用 KOH 和 HCl 调）（二）最后酶要悬浮在 Buffer A 中，因此要用超纯水。其他缓冲液用蒸馏水即可，也可用超纯水。Lysis Buffer：10mM TrisHCl （pH7.9）50mM KCl1mM EDTAK +（pH7.9）0.5%（ v/v）Tween-200.5%（ v/v）NP401mM PMSF（用前再加）配法：（FOR 200ml）1M TrisHCl（pH7.
5、9） 2ml0.5M EDTAK +（pH7.9） 0.4ml1M KCl 10ml10% Tween20 10ml10%NP40 10ml灭菌后加入 PMSF 0.03484g。 （以约 300500l 异丙醇溶解，缓慢加入）Note： PMSF 可用异丙醇溶解后缓慢加入，也可直接将粉末倒进去剧烈振荡。 （PMSF 剧毒，注意防护）PreLysis Buffer：即 Buffer A 中加 Lysozyme 至 4mg/ml。 （现配现用）1Storage Buffer：（200ml，溶解酶用，-20保存）50mM TrisHCl（pH7.9）0.1mM EDTAK +50mM KCl0.5
6、mM PMSF1mM DTT配法：1M TrisHCl（pH7.9） 10ml0.5M EDTAK +（pH7.9） 0.04ml1M KCl 10mlPMSF 0.01743g定容至 100ml，再加甘油 100ml。灭菌后加入过滤除菌的 DTT。1M DTT 过滤除菌后加入 0.2ml，即终浓度为 1mM（配法：1.543g10ml 超纯水或0.7715g5ml 超纯水，过滤除菌后小管分装。-20保存）Note：（一）PMSF 可用异丙醇溶解后缓慢加入，否则易析出。（二）DTT 易降解，因此要在 Buffer 灭菌后加入，并且在低温保存。1Storage Buffer：（2L 透析用）50
7、mM TrisHCl（pH7.9）0.1mM EDTAK +50mM KCl0.5mM PMSF1mM DTT配法：1M TrisHCl（pH7.9） 100ml0.5M EDTAK +（pH7.9） 0.4ml1M KCl 100mlPMSF 0.1743g定容至 1000ml，再加甘油 1000ml。灭菌后加入过滤除菌的 DTT。1M DTT 过滤除菌后加入 2ml。（3）挑斑摇菌5ml LB 加 Amp 至 80g/ml。2 管（用同一个斑，并标记该斑） ，37过夜。 （本次试验中由20：309：30）第三天 酶的诱导表达（1）转瓶：LB 加 Amp 至 80g/ml(即浓度为 100m
8、g/ml 的 Amp 在 1L 的培养基中加 800l)，加菌液 500l/L，37摇菌。预计 21：00 可加 IPTG 诱导。Note： 本次试验中由 10： 3020：00，OD 550 值达到 1.663，应在 0.8 左右最好。达到 1.8 亦可。（2）保存菌种：400l 菌液加 400l菌种保存液，-70保存。（3）清理器皿：检查是否有未灭菌的器皿，将用过的器皿清洗灭菌。（4）测 OD 值，加 IPTG（250mg/ml）至 125mg/L（0.5mM。500l1L）37摇菌，12hr。Note:（一）诱导 IPTG 一般加到 1mM，诱导时间相对较短， 2mM 为饱和值。本次试验
9、将浓度降低，时间相应延长，以便过夜摇菌。（二）加 IPTG 前取样（500l2）以备做蛋白胶对照。明早离心前再取样预备跑蛋白胶。菌液离心后收集菌体 4保存。（三）IPTG 诱导 12hr，明早 8：00 前要调水浴锅至 75（精确！） 。同时离心转子预冷至4。第四天 提 Taq 酶为避免污染，所有操作都要戴手套，常换手套和枪头。（1）收集菌体：8：30 离心，5000rpm，4，15min，500ml 离心管2，收集两次，共 2L。Note： 以下操作在冰上进行，与制感受态类似。（2）洗涤：Add 100mlBuffer A per liter origin culture volume，转至
10、 250ml 离心瓶2；6000rpm，4，12min ，冰上。（3）Pre Lysis：Add 50ml PreLysis Buffer per liter origin culture volume（先加 50ml Buffer A per liter，充分悬浮，再加 Lysozyme 至 4mg/ml，摇匀） ，室温放置 15min，合并至一个 250ml 离心瓶中。（4）热变性沉淀杂蛋白：在 Lysis Buffer 中加入 PMSF，待用。加入等体积的 Lysis Buffer，转入 250ml 三角瓶中，75，1hr。（5）除去沉淀：15000rpm 或 17000rpm（Beck
11、man）4,15-20min。取上清，转入干净的三角瓶中，用灭菌的 100ml 量筒量取体积。（6） （NH 4） 2SO4 沉淀 Taq 酶：用小烧杯称取硫酸铵（按 30g/100ml 上清）在室温慢加慢摇。边加边摇。本次试验摇了两个小时。Note：（一）避免局部盐浓度过高导致 Taq 酶析出，要加一点摇一会。（二）摇烧杯时要注意不要产生泡沫，泡沫会使酶活性降低。（三）大约加入一半硫酸铵时溶液会浑浊，若沉淀出现太早表明杂蛋白未除尽，可在透析之后离心除去。（7）离心沉淀 Taq 酶：转入 50ml 离心管，15000rpm 或 18500rpm（Beckman ）室温，25min。弃上清，沉淀
12、重悬在 5ml Buffer A per 100ml 上清。Note：（一）若在 4离心则沉淀很少。（二）上清可倒在三角瓶中多离心几次便可以将沉淀完全离心下来。（8）透析：将透析袋用透析夹夹紧，透析袋中避免有气泡，可用手将气泡挤出（戴手套！）每个透析袋约 10ml在 Storage Buffer 中加入 DTT（切记！）在 1000ml 烧杯中倒入约 400500ml，放入磁转子，4缓慢搅拌，每隔 12hr 换一次透析液。Note：（一）透析袋可多折几次以免夹得不紧。（二）透析时烧杯要封口（可用 PE 手套）第五天 透析早晚各换一次透析液，原透析液倒掉，切勿造成酶的污染！Note：Storage Buffer 平时放在 4可防止 DTT 降解，也可保证换透析液时酶保持低温。第六天 透析回收早上 8：009：00 换一次透析液，下午 4：005：00 可收酶。（1）剪掉多余的透析袋，用枪将酶吸出，放入 10ml 离心管，用 Storage Buffer1：1 稀释，20保存。Note：（一）酶液的颜色为淡黄色澄清液体。（二）若出现白色沉淀，可在 4，13000rpm 离心 5min，取上清。
