1、1蛋白质组实验流程双向电泳的样品的制备样品制备原则样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响 2-DE 结果好坏。目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫 脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，如 CHAPS与 Zwittergent 系列等双性离子去
2、垢 剂；还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT ）和磷酸三丁 酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入 Tris-base,蛋白酶抑制剂以及核酸酶。样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通 过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏 IPG 胶条，这样 都会造成 2-DE 的失败。 样 品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。核酸的去除可采用超声或
3、核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但 时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白 质的部分损失。因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所 处的状态以及实验目的和要求来进行选择。目前有很多方法适于 2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白（如磷酸化蛋白、采用亲合纯化凝集素结合蛋白等）。一、细胞样品1. 细胞培养，加药与处理。2. 胰酶消化贴壁细胞，PBS 漂洗 3 次(1500，5min)，弃上清, 再次离心，
4、去尽残液（非常重要！）。如要比较细胞膜蛋白组的差别，最好用细胞刮收获细胞。如用 10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替 PBS，可有效降低样品的盐浓2度。加入 5 倍体积裂解液，混匀（或将 1106细胞悬于 60100l 裂解液中）。3. 加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml Dnase，在 4放置 15 分钟。4. 15,000 转，4离心 60 分钟（或 40,000 转，4离心 30 分钟）。5. 收集上清。6. 测定蛋白浓度(采用 BioRad RC/DC protein assay kit)。7. 分装样品，冻存于70。二、组织样品1.
5、 碾钵碾磨组织，碾至粉末状。2. 将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。3. 加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml DNase，在 4放置 15 分钟。4. 15,000 转，4离心 60 分钟（或 40,000 转，4离心 30 分钟）。5. 收集上清，测定蛋白浓度。6. 分装样品，冻存于70。注意事项：1. 8 mmol/L PMSF 必须在添加还原剂之前用，否則 PMSF 会失去活性。2. 40 mmol/L 浓度以下的 Tris 可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。3. 细胞清洗大多用 PBS，若 PBS 残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹，则可利用
6、(10 mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此问题。双向电泳操作步骤水化上样(被动上样)1. 从冰箱中取出 IPG 胶条，室温放置 10min。2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各 1cm 左右不加样，中间的样品液一定要连贯.注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。3. 用镊子轻轻撕去 IPG 胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。4. 将 IPG 胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上.注意:不要将样品溶液弄到胶条背面,因为这些溶液不会被胶条吸收;还使胶条下面的溶液 产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶
7、条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。5. 放置 3045min 大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约 3ml(17cm IPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。6. 置等电聚焦仪于-20水化 1115h。第一向 等电聚焦1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加 ddH2O 58l 润湿。32. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于 刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。3. 将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。4. 在每根胶条上覆盖 2-3ml 矿物油。5. 对好正、负极，盖上盖子
8、。 设置等电聚焦程序。6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE 电泳。或将胶条置于样品水化盘中，-20 冰箱保存， 电泳前取出胶条，室温放置 10 分钟，使其溶解。第二向 SDS-PAGE 电泳1. 配制 12%的丙烯酰胺凝胶。2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的 MilliQ 水、乙醇或水 饱和正丁醇，用 MilliQ水冲洗。3. 配制胶条平衡缓冲液 I4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用 MilliQ 水浸湿， 挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。5. 将
9、胶条转移至样品水化盘中，加入 6ml(17cm IPG)平衡缓冲液 I，在水平 摇床上缓慢摇晃 15 分钟。6. 配制胶条平衡缓冲液 II。7. 第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液 II 中，继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。8. 用滤纸吸去 SDS-PAGE 胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。10. 在 100ml 量筒中加入 TGS 电泳缓冲液。11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完
10、全浸末在 1电泳缓冲液中漂洗数次。13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。14. 用适当厚度的胶片,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触.注意:不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。15. 放置 5 分钟，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。16. 打开二向电泳制冷仪，调温度为 15。417. 将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始 时用的低电流（5mA10mA/gel/17cm），待样品在完全走出 IPG 胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（20-30mA/gel/17cm ）待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
11、18. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作 记号（戴手套，防止污染胶面）。19. 进行染色。SDS-PAGE 胶染色一、各种蛋白染色方法的灵敏度比较染色方法 灵敏度 与质谱的兼容性Silver 1-10ng -Silver (MS compatible) 10ng +Comassie G-250 or R-250 30ng +Antibody (Western blot) 1ng -二、考马斯亮蓝染色CBB 染色液0.5%考 马斯亮蓝 G250 或 R25040%甲醇10%乙酸将 CBB 溶于甲醇中并不停的搅拌 15min。加入乙酸与 ddH2O脱色液：30% 甲醇10%乙酸染
12、色方法：1.在摇床上染色 30min.2.脱色至蛋白点或条带清晰可见3. ddH2O 洗 3-5 次三、胶体考马氏亮蓝染色 Colloidal Coomassie Staining（Cambridge centre for porteomics） sensitivity = 100ng1. 固定：甲醇/醋酸/H 2O(45:1:54)至少 20min.2. 染色 12-18hr。染色液： 17% (w/v) 硫酸 铵34%甲醇0.5%醋酸0.1% (w/v) Coomassie G2503. 脱色：用 H2O 脱色至蛋白点和背景清晰.5双向电泳蛋白点的切取和保存1. 用 PDQuest 软件或
13、肉眼比对，找出感兴趣的蛋白点，并做好标记和记录。2. 用 MilliQ 水冲洗胶 2 次。3. 用色谱纯甲醇和 MilliQ 水冲洗 Ep 管4. 将枪头(200l) 下端剪去，使其内径略小于蛋白斑点的直径，用色谱纯甲醇和MilliQ 水冲洗枪头。 5. 对准斑点中央小心将蛋白切割下来，放入 Ep 管，MilliQ 水漂洗 2 次，如胶块太大，将其切成 1 x 1 mm 的胶片。6. 将切好的点做好标记和记录，置-80 oC 保存或冻干后-20 oC 存放。注意事项：1. 尽量避免皮肤和头发的角蛋白的污染，在操作过程中应戴一次性的 PE 手套（不用乳胶手套）和帽子。2. 不要将胶长期存放于乙酸
14、溶液中。3. Ep 管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗，尤其应与进行 Western blotting的容器分开，以避免 casein 或 BSA 的污染。数据库搜索(Databases search)一般来说,利用质谱数据鉴定蛋白质主要有两种方法:肽质量指纹图谱（PMF ）和肽序列标签分析（sequence tag analysis）。这两种方法较传统的 N 端测序或内部 Edman 测序法敏感数百倍，其 检测低限为飞摩尔 （fmol）水平（如银染的 2D 胶点或 1D 胶带）。然而，足够 多的样品蛋白量可以增加识别的成功率，这是因为增大样品蛋白量可以克服一些污染物的干扰（如角蛋白，在样品
15、中的存在非常常见）。数据库 的检索是利用计算机程序算法将 实验测得的肽质量数据与蛋白质序列数据库中的蛋白质的肽质量计算值进行相关性比较分析，从而得出可能蛋白质的概率并将相关性最好的结果排序， 这是凝胶分离蛋白质鉴定的最常用手段。这种检索途径有一个明显的限制，就是被鉴定的蛋白质必须在序列数据库（蛋白质数据库和核酸序列翻译数据库）中存在。PMF 检索鉴定蛋白质是依据实验中获得的蛋白质的多个肽段质量数据与同一蛋白质肽段质量理论计算值的之间的相关性比较。因此， 这一技 术不适用于检索 EST 翻译序列，也不适用于鉴定蛋白质的混合物。而肽序列 标签分析（sequence tag analysis）可适用
16、于检索 EST 数据库。对PMF 数据，主要搜索Swiss Prot (速度快但不全面)和NCBI (速度虽慢但包含更多的信息) 数据库。如果你认为你的蛋白质可能为新的蛋白质，选择NCBI数据库，标 准搜索选择Swiss Prot 数据为好。如果需要，也可搜索EST数据库（用MS/MS数据按搜索更有效）。6检索条件的设置与结果判断：1. 肽片段质量选择在 800-4000Da 范围。2. 氨基酸残基的修饰（Modifications）：半胱氨酸为脲甲基半胱氨酸（Cardamidomethyl-Cys），蛋氨酸 选择可变修饰氧化。3. 最大允许的肽质量误差（Mass Tolerances），与仪
17、器性能和数据质量有关，一般设为0.1Da，最大 为0.5Da，质量误差愈小，搜索的特异性愈高。4. 不完全酶解位点数目（Missed cleavages）：每个肽允许有 2 个不完全裂解位点，一般选 1（如果蛋白充分变性且酶解完全）。5. 参考蛋白质表观分子量和等电点，表观 PI 误差范围为0.5pH，表观 Mr 误差为范围为20%。一般情况下不选此项，在判 读结果 时参考。6. 物种选择：限定物种。7. 离子选择：M+H +，单同位素8. 最少匹配肽片段规定为 4。双向电泳常见问题与原因IEFToo much salt in the sample (disturbs IEF)acetone
18、precipitation to remove salts and other contaminants Charged impurities in the sampleacetone precipitation to remove salts and other contaminantsImpurities in the sample or rehydration solutionacetone precipitation to remove salts and other contaminantsPrepare new rehydration solution Lower pH left
19、(e.g. pH 4-7): overfocused Lower pH right (e.g. pH 7-4): underfocused Prolong or lower the focusing time of the IEFSDS-PAGE, staining7Gel surface during polymerization not overlaid with water (or too low amount of water used)Apply at least 1 ml to overlay the gel surfaceNo uniform gel polymerization
20、 (e.g. impurities at gel cassettes, air bubbles in the polymerized gel)Clean gel cassettes with ethanolCast the slab gel slowly (approx. 1 min)Overlay the gel carefully with destilled waterNot all proteins (especially high molecular mass proteins) saturated with SDSUse 0.15 % instead of 0.1 % (w/ v)
21、 SDS in the 1 x SDS buffer for SDS-PAGEHigh sample load (protein disturbs of other spots or may not be fully saturated with SDS)Lower the protein amountImpurities on or within the 2-D gel still present during silver stainingClean the gel cassettes prior casting with ethanolIncubate the 2-D gels long
22、 enough (and with at least 100 ml/ gel) in fixing and washing solution prior staining聚丙烯酰胺凝胶的配制表 1 配制 Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）溶液成分 5 10 15 20 25 30 40 506%水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.530%丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 1081.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10
23、 12.510% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.510%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.048%水 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.230%丙烯酰胺溶液 1.3 2.7 4 5.3 6.7 8 10.7 13.31.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.510% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
24、 0.3 0.4 0.510%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.0310%水 1.9 4 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.830%丙烯酰胺溶液 1.7 3.3 5 6.7 8.3 10 13.3 16.71.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.510% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.510%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0
25、.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.0212%水 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.530%丙烯酰胺溶液 2 4 6 8 10 12 16 201.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.510% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.510%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.002 0.004 0.006 0.0
26、08 0.01 0.012 0.016 0.0215%水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.530%丙烯酰胺溶液 2.5 5 7.5 10 12.5 15 20 251.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.510% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.510%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02表 2 配制 6% Tris-甘
27、氨酸 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5%积层胶所用溶液9不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）溶液成分 1 2 3 4 5 6 8 10水 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.830%丙烯酰胺溶液 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1 1.3 1.71.5 mol/L Tris (pH8.8) 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 0 1.2510% SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.110%过硫酸氨 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08
28、0.1TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01双向电泳常用溶液配方A. 水化/上样缓冲液(rehydration/sample lysis buffer)水化上样缓冲液（I） 1mlurea 8M 0.48gCHAPS 4% 40mgDTT 5065mM 79.8mg or TBP 2mM 10l40% Bio-Lyte 0.2%(w/v) 5l1%溴酚 蓝 0.001% 1lMilliQ水 650l水化上样缓冲液（II） 1ml urea 7M 0.42gthiurea 2M 0.152gCHAPS 4% 40mgDTT 506
29、5mM 79.8mgor TBP 2mM 10l40% Bio-Lyte 0.2%(w/v) 5l1%溴酚 蓝 0.001% 1lMilliQ水 650l1. 水化上样缓冲液（I）中的尿素浓度可以调高到9或者9.8M ；用7M Urea和2M Thoiurea溶解蛋白的能力较单用尿素强。2. 目前常用的去垢剂为CHAPS ，也可用 Triton X-100、NP-40等代替。3. 可以加蛋白质酶的抑制剂和/核酸酶。 4. 还原剂可用DTT 或TBP，分离碱性蛋白 时最好用 TBP。 105. 5溴酚蓝作为指示剂，可以监测上样和聚焦过程，如操作熟练，可以不加。 .B溴酚蓝储液Final conc
30、entration AmountBromophenol blue 1% 10mgTris-base 50mM 6mgMilliQ H2O to 1mlC. 胶条平衡液贮存液（SDS equlibration buffer）(50mM Tris-cl pH8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 2% SDS, bromophenol blue, 200ml)Final concentration Amount1.5M Tris-cl,pH8.8 Urea (Fw 60.06)Glycerol(87% v/v)SDS(Fw 288.38)1%Bromophenol blue sol
31、ution50mM6M30%(v/v)2%(w/v)0.002%(w/v)6.7ml72.07g69ml4.0g400l To 200ml分装后贮存于-20；溴酚 蓝可以不加；用之前在加DTT(20mg/ml)或者碘乙酰胺(25mg/ml)。D. 10% (v/v)SDS溶液SDS(Fw 288.38) 10.0g MilliQ H2O To 100 ml用0.45微米的滤纸过滤室温保存(高纯试剂一般不用过滤)E. 聚丙 烯酰胺单体贮存液（Monomer stock solution）Final concentration AmountAcrylamide 30% 150gN,N-methyl
32、enebisacrylamideor PDA0.8% 4.0g5.0gMilliQ H2O To 500ml用0.45微米的滤纸过滤(可不过滤), 4 避光保存F. 4x分离胶溶液(4x Resolving gel buffer, 1.5M Tris-Cl pH8.8)Final concentration Amount11Tris-base(Fw 121.1)MilliQ H2OHCl(Fw 36.46)1.5M 181.5g750mlAdjust to pH8.8 MilliQ H2O To 1000ml用0.45微米的滤纸过滤，4保存G. 10%过硫酸铵Final concentrati
33、on Amount Ammonium persulphate(APS)MilliQ H2O10% 1gTo 10ml当加入水时，新鲜的过硫酸铵会发出“咔嚓”声音。如果没有声音， 则需要换新的药品。可少量(10ml)配制，分装后 4保存。H. 电泳缓冲液（TGS electophoresis buffer ）(25mM Tris,192 mM glycine, 0.1%SDS)Final concentration Amount Tris baseGlycine SDSMilliQ H2O25 mM192mM0.1%(w/v)15.1g 7.55g72.1g 36.05g5.0g 2.5gTo
34、5000ml To 2500ml该溶液的pH值不需调整，可直接在大 试剂瓶中配制溶液，室温保存。J. 琼脂糖封胶液（Agrose sealing solution）Final concentration Amount TGS electophoresis bufferAgrose (NA or M)1% Bromophenol blue-0.5%0.002%(w/v)50ml0.25g100l可在锥形瓶配制，微波炉加热熔化。小份分装，室温保存。 相关帮助需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医 疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网进行咨询：http:/需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎：http:/
