1、 BCL-2 ISH Detection KitBCL-2 原位杂交检测试剂盒使用说明书产品编号：MK1050 保存：置。 工作量：100 张切片。 有效期：一年。BCL-2 是主要的抗凋亡基因。本试剂盒采用针对人、大鼠、小鼠的 BCL-2 特异性的寡核苷酸探针，经地高辛标记。 由于采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术，并配合使用敏感性加强型的原位检测方法，具有敏感性特别高，背景清晰，结果准确可靠的优点。可以检测出常规福尔马林固定，石蜡包埋标本的 BCL-2 mRNA 序列。针对人 BCL-2 靶基因的mRNA 序列为：（1） 5GATGA AGTAC ATCCA TTATA AGCTG TC
2、GCA3；（2） 5GCGCT CAGCC CGGTG CCACC TGTGG TCCAC3；（3） 5GGGAG ATGTC GCCCC TGGTG GACAA CATCG3；大鼠、小鼠和人的序列仅 3bp/90bp 不同。兔和人序列基本相同。适用种属：人、大鼠、兔、小鼠组织。试剂盒中内容1.胃蛋白酶（10; Pepsin）2ml； 2. 预杂交液 2ml； 3. BCL-2 寡核苷酸探针杂交液 2ml； 4. 封闭液 5ml; 5.生物素化鼠抗地高辛 5ml; 6. SABC-POD 5ml；7. 生物素化过氧化物酶 5ml。用户自备试剂：原位杂交专用盖玻片（博士德有售） ；POLY-L-
3、LYSINE ；DEPC；20%甘油缓冲液（3%柠檬酸,2SSC， 0.5SSC，0.2SSC， 原位杂交用 PBS ）一培养细胞和冰冻切片准备工作：固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6） ；1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6）3%柠檬酸100ml 蒸馏水中加柠檬酸（C6H8O7H2O）3g,PH2.0 左右。2SSC1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g，柠檬酸三钠（C6H5O7Na32H2O，分子量 294）8.8g。0.5SSC300ml 蒸馏水加 100ml 2SSC 即可。0.2SSC270ml 蒸馏水加 30ml 2SSC 即可。20%
4、甘油20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。原位杂交用 PBS0.02M phosphate ；0.5M NaCl(1000ml 蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO412H2O 6g, NaH2PO42H2O 0.4g),PH7.2-7.6。操作程序： 注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入 0.1%的 DEPC 处理，以抑制 RNA酶对 mRNA 的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。1玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或 APES。切片厚度 10-20m。2细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为 37和 5%的 CO2，所用培养基为 Dulbecco 基础培养基。细
5、胞长好后 0.1M PBS(PH7.4)洗 2 分钟3 次。3培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为 4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6） ，含有 1/1000 DEPC。室温固定 20-30 分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20冰冻可保存 2 周以上。430%H2O2 1 份+纯甲醇 50 份混合，室温处理 30 分钟。蒸馏水洗涤 3 次。5暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加 2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀） ，37或室温消化 5120 秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS 洗 3 次5 分钟。蒸馏水洗 1 次
6、。6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为 1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6） ，含有1/1000 DEPC。室温固定 10 分钟。蒸馏水洗涤 3 次。7. 预杂交：湿盒的准备干的杂交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持湿度。按每张切片20 加预杂交液。恒温箱 38-4224 小时。吸取多余液体，不洗。8. 杂交按每张切片 20 杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱 38-42杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。 9. 杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37左右水温的 2SSC 洗涤 5 分钟2 次；370.5SSC 洗涤 15 分钟1 次;
7、370.2SSC 洗涤 15 分钟1 次(如果有非特异性染色，重复 0.2SSC洗涤 15 分钟1-2 次)。10.滴加封闭液：3730 分钟。甩去多余液体，不洗11.滴加生物素化鼠抗地高辛： 37 60 分钟或室温 120 分钟。原位杂交用 PBS 洗 5 分钟4 次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。12.滴加 SABC：3720 分钟或室温 30 分钟。原位杂交用 PBS 洗 5 分钟3 次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。13.滴加生物素化过氧化物酶：3720 分钟或室温 30 分钟。原位杂交用 PBS 洗 5 分钟4 次。14.DAB 显色：使用 DAB 显色试剂盒1ml 蒸馏水加显色剂，C
8、各一滴，混匀，加至标本上。一般显色 20-30 分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配 DAB 显色剂后显色。充分水洗。15.必要时苏木素复染，充分水洗。16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。二石蜡切片如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为 4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6） ，含有 1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过 4mm的小块，固定 1 小时即可，较大的标本固定不要超过 2 小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间 30-40 分钟，一般不要超过 1 小时。1 常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度 6-8m
9、。2 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或 APES。3 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1 份+蒸馏水 10 份混合,室温 5-10 分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗 3 次。4暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加 2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀） ，37或室温消化 3-30 分钟（视标本新旧、厚薄自行调整） 。用户可以比较不同的消化时间，例如 5 分钟,10 分钟，20 分钟，30 分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用 PBS 洗 3 次5 分钟。蒸馏水洗 1 次。其余步骤和冰冻切片 6-16 步相同。结果观察：BCL-2 mRNA 的细胞胞浆着色呈棕黄色。注意事项：由于特定的 mRNA 序列仅占总 mRNA 的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释 210 倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。武汉博士德生物工程有限公司
