1、western blot）-试剂配制与操作步骤(2008-04-01 16:55:48)标签：杂谈 蛋白印迹（western blot）-试剂配制1 30%丙烯酰胺溶液 溶解 29.2g 丙烯酰胺和 0.8g N,N-亚甲基甲叉双丙烯酰胺于纯水中，搅拌至充分溶解后，定容至 100ml。过滤后于 4避光保存。2 4分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl,pH8.8）18.15g Tris 溶于 80ml 纯水中，用 1 mol/L 盐酸调至 pH8.8，定容至 100ml。于 4保存备用。3 4浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8）6.055g Tris 溶于
2、80ml 纯水中，用 1 mol/L 盐酸调至 pH6.8，定容至 100ml。于 4保存备用。4 10%过硫酸胺（APS，临用前配制） 过硫酸胺 1.0g 溶于 10ml 纯水中，充分混匀，4避光保存，一周内稳定。5 四甲基乙二胺（TEMED）6 10%SDS 10g SDS 于 100ml 纯水中，缓缓搅拌使其完全溶解，室温保存。7 电泳缓冲液 称取 3.0g Tris，甘氨酸 14.4g，溶于 900ml 纯水中，充分混匀，溶解后加入 10%SDS 10ml，定容至 1000ml，混匀后室温保存。8 转移缓冲液 称取 Tris2.4g，甘氨酸 11.5g，溶于 700ml 纯水中，充分溶
3、解后，加入甲醇 200ml，定容到 1000ml，室温保存。9 6上样胶缓冲液 6ml 上层胶 buffer, 1.2gSDS, 少许溴酚兰，加热充分融解，加4ml 甘油，加 DTT 0.9255g 充分混匀后分装，-20保存备用。10. RIPA 裂解液 50mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl,1%NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，溶解混匀后于 4保存备用，临用前加入蛋白酶抑制剂（cocktail,1000）至所需浓度。11. 0.01%考马斯亮蓝染液 10mg 考马斯亮蓝 G-250，先加入 10ml 95%磷酸，5ml 无水乙醇，搅拌至充分溶解
4、后，定容至 100ml，过滤后于 4避光保存。12. 0.02mol/L PBST 缓冲液 称取 Na2HPO412H2O 7g, NaH2PO42H2O 0.7g,NaCl 9g,用 900ml 纯水搅拌溶解后，加入 Tween-20 0.5ml，调节 pH 至 7.4，纯水定容至 1000ml，室温保存。13. 印迹缓冲液 称取无脂蛋白粉 1g 溶解 100ml 0.02mol/L PBST 缓冲液，搅拌混匀后，4保存，一周内稳定。14. 30%H2O2蛋白印迹（western blot）-制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶1模具准备 用 BIO-公司的 mini 型垂直板型电泳装置，宽窄两块玻
5、璃板各一块，制备凝胶的厚度为 1.5mm，固定在注胶架上，准备灌注凝胶。2 制备和灌注 12.3%的分离胶 (两块胶量)在一 50ml 的离心管中，按顺序依次加入 4分离胶缓冲液 4.0ml，纯水 5.4ml，30%丙烯酰胺溶液 6.6ml，10%SDS 180l，10%过硫酸胺溶液 120l，TEMED 12l。混匀后立即注入模具腔，直至 5.5cm 左右的高度为止。在凝胶上方加入纯水以进行水封。当水封层与凝胶层之间出现明显的折光界面时(约 40-60min)，表明分离胶的聚合已经完成，用一注射器小心吸去水封层，准备灌注上层浓缩胶。3. 5%浓缩胶的制备和灌注在另一 50ml 离心管中，按顺
6、序依次加入 4分离胶缓冲液 2.0ml、纯水 4.6ml、30%丙烯酰胺溶液 1.34ml、10%SDS 80l、10%过硫酸胺溶液 40l 和 TEMED 16l。混匀后，缓缓注入模具腔内分离胶的上面，直至液面与模具玻璃板上沿平齐。小心将样品梳插入凝胶液体中，注意勿使其中产生气泡。室温静置约 30min 后，浓缩胶聚合即完成。将凝胶安装在电泳支架上，轻轻拔掉样品梳，立即用电泳缓冲液冲洗样品孔。在电泳槽中加入电泳缓冲液至所需量，准备上样。蛋白样品处理取 30g 蛋白样品(20l)，加入上样缓冲液 4.5l，-巯基乙醇 3l，混匀，100煮沸5min。加 样将煮沸后的样品全部加入孔内，每泳道总体
7、积为 27.5l。电泳电压的配置接通电源，先以 60v 电压恒压电泳。至样品基本进入分离胶后，再改电压为 100v，恒压电泳至电泳指示剂迁移到分离胶下游边缘时(约 3-4h)，停止电泳，准备转膜。转 膜以 Bio-Rad 半干式电转移装置进行操作。取 8cm5.5cm 硝酸纤维素膜一张，将膜及凝胶一起在转移缓冲液中平衡 30min 左右（PVDF 膜先用甲醇泡两分钟），所用滤膜在转移缓冲液中浸泡 5min 左右。按夹心法从下至上依次为滤膜、硝酸纤维素膜、凝胶和滤膜。小心去除夹层内的所有气泡，盖上盖板，接通电源，0.16A 恒流电泳 80min，0.17A 恒流电泳70min，0.2A 恒流电泳
8、 60min。蛋白印迹（western blot）-染膜操作1. 封闭硝酸纤维素膜 用无脂蛋白粉 2.0g，加 0.02mol/L PBST 100ml，20-37封闭 2h。2. 用 0.02mol/L PBST 洗涤硝酸纤维素膜 5min2 次。3. 配制抗体稀释液 取 95ml 0.02mol/L PBST 加入 1.0g 无脂蛋白粉和 5ml 浓缩抗体稀释液即可，4可保存一周。4. 加一抗 用抗体稀释液稀释相应的一抗，20-37孵育 3h 或 4过夜。5. 用 0.02mol/L PBST 洗涤硝酸纤维素膜 5min4 次。6. 加二抗 用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的二抗（1：3
9、00），20-37孵育1h。7. 用 0.02mol/L PBST 洗涤硝酸纤维素膜 5min6 次。8. DAB 显色 用 0.02mol/L PBST 稀释 DAB 浓缩液（40），同时按 1：1000 的比例加入 30% H2O2,混匀后加至膜上，室温显色至所需颜色深浅，以蒸馏水洗涤终止显色。干燥避光保存硝酸纤维素膜(每 2ml PBST 加一滴 DAB 加 2ul30% H2O2)。9. 或者 ECL 曝光 洗膜时间延长至 810 次，配底物：900ul 水50ul 20luminglo+50ul peroxide, 将膜从 PBST 中取出后在虑纸上轻靠片刻去除多余水份，膜正面向上贴
10、在塑封膜上，加底物反应 1 分钟，将膜放入曝光盒中（膜之间不要气泡）。以下过程在暗室中进行，加底片曝光 25 秒至适当，取出底片置于显影液 1 之数分钟，水冲洗1 分钟，定影 1 分钟，水冲洗 1 分钟。（显影，定影液配置请见包装袋说明）10. 观察、照相，将条带转换进电脑后进行分析。11. 151545KD 12.5%-15-60KD10%-18-75KD 7.5%-30-120KD5%-60-212KD5%(上层胶) 75 10 125 15ddH2O (ml) 2.3 4 3.3 2.7 2Buffer (ml) 1 2 2 2 230%ACR (ml) 0.67 2 2.7 3.3 4
11、10%SDS (ul) 40 90 90 90 9010%AP (ul) 20 60 60 60 60TEMED (ul) 8 6 6 6 6WESTERN BLOTTING USING CHEMILUMINESCENCEFabiola Paula Lopes, Alice de Moraes and Peter J. HansenP.J. Hansen Home Page More Protocols from the LabREAGENTSECL Western blotting kit (Amersham Life Science; cat# RPN2108): contains sec
12、ond antibodies for both mouse and rabbit, substrate and milk blocker (the milk blocker is not normally used when using ruminant samples).Hybond ECL nitrocellulose membrane (Amersham Life Science; cat # RPN2020D)Kodak X-OMAT (XAR-5, 18X24 cm; cat # 8532665)10X TBS12.11 g Tris-base (100 mM)87.66 g NaC
13、l (1500 mM)1 liter dd H2OAdjust pH= 7.6Washing buffer (TBS-T): 100 ml 10X TBS + 900 ml dd H2O + 1 ml Tween-20.Blocking buffer: TBS-T + 1.5% gelatinIncubation buffer I (for first antibody): TBS + 1.5% gelatinIncubation buffer II (for second antibody) = blocking buffer (i.e., TBS-T + 1.5% gelatin)PROC
14、EDURES1- Immediately after removal from the blotting apparatus, place membranes into blocking buffer for 2 hours. A small plastic gel box is a suitable container. This and all other incubation steps are performed at room temperature and in the rocker platform.2- Wash membrane in washing buffer: rins
15、e 2 times very briefly, incubate for 15 minutes, then repeat 2 x at 5 minutes each. Use a lot of buffer.3- Transfer the membrane to a lid of 96-well microtiter plate or similar low volume container. Incubate with first antibody using recommenced dilution in TBS + 1.5% gelatin during 2 hours. Approxi
16、mately 10 ml of diluted antibody showed to be sufficient.4- Transfer the membrane into gel box and repeat step # 2.5- Transfer the membrane back to the small container and incubate with anti-mouse or anti-rabbit IgG horseadish peroxidase diluted 1:8000 in TBS-T + 1.5% gelatin for 1 hour.6- Repeat st
17、ep # 4 (wash)7- Prepare ECL solution for detection: mix equal volume of ECL reagent 1 and 2, (1:1) with final volume regarding of 0.125 ml/cm2 (for a mini gel- 4 ml of each reagent).8- Remove excess buffer from the membrane by draining the membrane over a piece of folded kimwipe paper and briefly to
18、uching the edge of the membrane to the paper.9- Add ECL solution and incubate for 1 minute.10- Repeat step # 8 ( drain excess of substrate)11- Place membrane down on seran wrap, remove bubbles and wrap membrane completely.Avoid excess amounts of seran wrap.12- Tape membrane to the inside film casset
19、te.13- In the dark, add 1 sheet of x-ray film to the cassette. Expose membrane to film. It will probably be necessary to do several different exposures to find out the best exposure.14- Develop the film.1%的 PBSA 就是称 1gBSA 溶于 100mlPBS 中即可BSA 是买的 sigma 分装的，浓度 1PBST 就是 PBS 和 Tween201、100mM 的 IPTG 是 2.4
20、gIPTG 溶于 100ml 水中：按照标准的配法，它不应该直接溶于 100ml 水中；应该先溶于少于 100ml 的水中。等溶解后再定容到 100ml;.2、在 8ml 蒸馏水中溶解 2g IPTG 后，用蒸馏水定容至 10ml，用 0.22um 滤器过滤除菌，分装成 1ml 小分储存与-20：这个配的是 20%的浓度，不是摩尔浓度。是储存液。实际用时通过计算加一定量就是了，便于保存。免疫组化试剂盒（见下表）+DAB 显色两种纯化噬菌体 DNA 方法的比较1 材料和方法噬菌体 gt11 贮存液以合适的滴度铺平板成单一噬斑,挑取一个新鲜噬斑(滴度1057 pfu/ml 放在 100 l SM
21、缓冲液中(氯化钠 5.8 g,硫酸镁 2.0 g,pH7.5,1 mol/L Tris-HCl 50 ml,2% 明胶 5 ml,加水至 1 L),4放置至少 4 h,让其充分释放。加 1 ml 10 8宿主菌(Y1090 r),3730 min。 加入含 1/100 V 0.5 mol/L CaCl2的 30 ml LB 培养液中(蛋白胨 10 g/L,酵母提取物 5 g/L,氯化钠10 g/L),37剧烈振摇 57 h,培养物可从清到混再变清。加 1 ml 氯仿继续在37振摇 30 min;离心(3400 g,10 min)除去细菌碎片,上清倒入干净的 50 ml离心管中,然后分两种方法继
22、续操作:聚乙二醇(PEG8 000)沉淀:加 RNA 酶(10 g/ml)和 DNA 酶(1 g/ml),37温育 1 h,加等体积含 2 mol/L 氯化钠的 20%聚乙二醇 8 000,置冰浴中 2 h,4 12 000 r/min 离心 10 min。沉淀加 0.5 ml 噬菌体缓冲液(20 mmol/L Tris HCl pH7.5； 100 mmol/L 氯化钠 ； 10 mmol/L 硫酸镁),8 000 g 4离心 2 min;上清转至微量离心管,用酚/氯仿抽提,12 000 r/min 离心 10 min 后,取水相加等体积之异丙醇,置-70 20 min,12 000 r/m
23、in 离心 10 min。沉淀用 70%乙醇洗盐后置室温干燥,再溶于含 RNA 酶(1 g/ml)的 TE 中,37消化 1 h,以酚/氯仿抽提。12 000 r/min 离心 10 min 后,取水相加半量体积 7.5 mol/L 乙酸铵、2 倍体积乙醇,置-70 1 h,12 000 r/min 离心 10 min。沉淀用 70%乙醇洗涤后于室温干燥,最后重溶于 100 l TE(10 mmol/L Tirs,HCl,1 mmol/L EDTA,pH8.0)。甘油超速离心:上清加 1/100 V 溶液 A(500 mg/ml RNase,50 mg/ml DNase,30 mmol/L p
24、H6.8 NaOAC,溶于 50%甘油,贮存于-20),37,30 min,10 000 g 离心10 min。上清缓慢加入一含有 5 ml 40%甘油(溶于 SM 缓冲液中)的超速离心管中,以水平转头 SW28,27 000 g,4离心 60 min。沉淀用 1 ml SM 缓冲液悬浮,加入 1/5 V 溶液 B(0.5% SDS,50 mmol/L pH8.0 Tirs.HCl,50 mmol/L pH8.0 EDTA),再加入 100 g/ml 蛋白酶 K,65,30 min。然后用 pH8.0 Tris.HCl 平衡好的酚抽提 1 次,酚/氯仿抽提 1 次,氯仿抽提 23 次,用等体积
25、的异丙醇沉淀,-20,30 min,12 000 g,离心 10 min，沉淀用 70%酒精洗 12 次,稍许干燥后,用 200 l TE(10 mmol/L Tris,HCl,1 mmol/L EDTA,pH8.0)重溶。2 结果和讨论用两种方法各提取 5 份噬菌体 DNA,15 号为甘油超速离心法所得,15号为聚乙二醇沉淀法所得(1 和 1对应,余相同)。各取 5 l 进行 1%琼脂糖凝胶电泳(15 号为 1/40 量,15号为 1/20 量)见图 1。从图中看出,15 号得率高,且无任何 RNA 污染;而 15号除了有较多 RNA 污染外,得率也低得多。图 1 两种不同方法提取并纯化的噬
26、菌体 DNA1%琼脂糖凝胶电泳图注: 15 号为甘油超速离心所得;15号为聚乙二醇沉淀所得噬菌体载体作为一种有效工具已得到广泛应用,因此得到高质量的噬菌体 DNA 日益显得重要。目前提取噬菌体 DNA 的方法较多,一般小量提取都遇到量少、不纯等难题 1；大量提取又费时费力，纯化起来又麻烦(如氯化铯超速离心既昂贵，也费时 2)。本文比较了两种不同的提取方法,认为甘油超速离心法较适用,不但得到的 DNA 量多、质纯、而且也不费时,除了运用到超速率心技术外,无需其它特别仪器和试剂,值得推广。用氯化铯离心法纯化噬菌体器材和试剂 L8M Beckman 超速离心机或与其相当的机型 吊桶式 SWTi4l
27、转头或相当类型 氯化铯(Sigma) PBS 纯化的噬菌体 样本方法1在每毫升最后的噬菌体悬液(例如来自实验方案 1311) 中，加入 045 g 氯化铯，充分混匀至溶解。2用吊桶式转头 (或与其相当的型号) 离心溶液，1517h，噬菌体将浓缩在组分 1 和组分 2 中( 。组分 1 的浓度较高，但组分 2 的体积较大。用巴氏滴管或塑料注射器吸取这些组分。如果是第一次使用本实验方案，那么先收集所有条带并分别对其检测将是明智之举。3将收获的溶液对 PBS 透析过夜。4通过感染大肠杆菌 DH5cF，或 TGl 滴定各个不同组分中噬菌体，并保存滴度最高的组分。通常，噬菌体会集中在 1 个区带内，而较
28、少的数量会分散在其他区带(如果可见 )。加入甘油至 10；按每份样本 1013 个噬菌体等量分装并储存于-80。更进一步的质量控制则可进行蛋白杂交印迹，采用抗标签抗体或抗 p抗体。用氯化铯纯化噬菌粒。离心后离心管外观如图示。噬菌体主要浓缩于碎片样区带( 组分 1)和其下的乳白色区带(组分 2)。两条区带均需收集 【摘要】 目的 建立一种能很好模拟人体内生物学行为的胃癌裸小鼠原位移植和转移模型。方法 采用人胃癌 SGC-7901 细胞株在裸鼠皮下经反复传 5 代形成实体瘤的完整组织块，建立人胃癌裸小鼠原位移植生长和转移模型 16 个。观察所建立的模型肿瘤生长状况、移植成功率和自发转移的发生率，常
29、规 H-E 染色光镜下观察胃癌原位移植瘤、胃癌淋巴结转移和肝转移情况。电镜下观察肿瘤超微结构及免疫组化 S-P 法检测肿瘤诱导型环氧化酶-2（COX-2）。结果 胃癌裸鼠原位移植块再次原位移植的原位成瘤率达 100（16/16），淋巴结广泛转移率为 87.5%（14/16），肝转移发生率为 75.0（12/16），腹腔积液形成率为 12.5%（2/16）。结论 原位移植和转移模型均具有人胃癌自然生长过程的特点，具有人胃癌的生物学活性。 【关键词】 胃肿瘤 肿瘤细胞 原位移植 疾病模型 裸小鼠Establishment of orthotopic implant and metastatic m
30、odels of humanstomach cancer in nude miceLIN Qi1, ZHOU Shifu2(1.Department of General Surgery, the First Peoples Hospital of Lianyungang, Lianyungang, Jiangsu 222000, China;2.Department of Oncosurgery, the Forth Peoples Hospital of Wuxi, Wuxi, Jiangsu 214000)Abstract： Objective To develop a nude mou
31、se model of human gastric cancer that can mimic its natural human biologic activities. Methods Human gastric cancer cell line SGC-7901 was cultured in nude mice repeatedly for 5 generations to get the subcutaneous solid tumor, which was then emulsified and orthotopicly inplanted into the anterior wa
32、ll of the stomach in 16 nude mice. The tumor growth characters, tumor-take rate and metastatic rate were studied grossly, the transplanted tumor and its lymphatic and hepatic metastases, after routine H-E staining; the ultrastructures, by electron microscopy; and COX-2, by immunohistochemical method
33、 Results The tumor-take rate was 100（16/16）, the rates of metastasis to lymph nodes and liver were 87.5（14/16） and 75.0（12/16） respectively, the rate of ascites formation was 12.5%（2/16）. Conclusion The model of human stomach cancer established is qualified, exhibiting natural growth characters and
34、biological activities.Key words: stomach neoplasms; orthotopic thansplantation; disease model; nude mouse既往胃癌动物模型的建立多采用皮下接种方式，虽然这种移植方式简单易行，肿瘤的生长情况也便于观察，且在一定程度上也近似地模拟了原有肿瘤的形态学、生物学及生物化学特性；然而接种于裸小鼠皮下组织毕竟属于异位移植，脱离了其起源组织器官的微环境，因此在实验中移植瘤的某些行为常不同于患者原发恶性肿瘤的生物学行为。如移植瘤常有包膜、局限性生长、很少发生局部或远处器官的转移，故未能很好地被应用于研究人癌潜
35、在的侵袭与转移特性。我们选用低分化胃腺癌细胞系 SGC-7901 通过裸鼠皮下传 5 代后再原位移植建立的动物模型局部呈浸润性生长、局部或远处有肿瘤转移，为胃癌的研究提供了一个很好的载体。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物 BALB/C/nu/nu 裸小鼠由中科院国家啮齿类上海实验分中心购买，繁育自无特殊致病原 (special pathogen free， SPF)实验动物屏障环境。雌雄兼用，56 周，体重（172.5） g，分笼饲养（每笼 5 只）。实验过程中均在 SPF 屏障环境内饲养。实验前 1 周购入小鼠，使之适应新环境。1.1.2 瘤株 人胃腺癌 SGC-7901 细胞
36、株，由中科院上海细胞生物研究所提供。癌细胞在含 10%小牛血清的 RPMI-1640 培养液中，于 CO2 恒温孵育箱中培养，常规传代。1.1.3 COX-2 羊抗人单克隆抗体及其免疫组化染色试剂盒购自苏州福佑生物技术有限公司。1.2 方法1.2.1 人胃癌裸鼠原位移植和转移模型的建立1.2.1.1 皮下移植瘤模型的建立 收集体外培养的 SGC-7901 细胞，使细胞含量为21010 个/L，取 0.1 ml 注入裸小鼠颈部皮下形成实体瘤。至肿瘤直径 1.5 cm 左右时，处死裸小鼠，切取肿瘤放入生理盐水（含 105 U/L 青霉素和 105 U/L 链霉素）中，去除包膜，选择近边缘新鲜组织大
37、约 1 mm3 以粗针穿刺接种于另一只小鼠，每次传代 4 只，反复传5 代后作为原位移植用瘤源。1.2.1.2 原位移植模型的建立 裸小鼠术前禁食 12 h，以 0.6戊巴比妥钠腹腔内注射（50 mg/kg）麻醉。常规消毒皮肤，取上述传 5 代后生长 3 周左右处于对数生长期的荷瘤鼠，常规消毒，从颈部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，剪成 1 mm1 mm1 mm 小块，以 8-0 丝线穿过浆肌层将上述一块瘤组织荷包缝扎在刮破浆膜的胃大弯前壁，荷包直径约 0.4 cm。分层关腹。术后精心饲养，每日观察 12 次，每周称 1 次体重。1.2.2 光镜和电
38、镜常规观察肿瘤形态学1.2.3 免疫组化 S-P 法检测肿瘤组织诱导型环氧化酶 -2（COX-2）表达判定标准 COX-2 表达阳性的判断以10%的肿瘤细胞的细胞质出现棕黄色颗粒者判断为阳性。2 结 果2.1 人胃癌组织块原位移植瘤的生长情况 共建立供生长特性观察的原位移植模型鼠 16只，成功率 100%（16/16 ）。移植术后 34 周于左上腹部可扪及直径 23 mm 质地较硬的结节，随后肿瘤结节逐渐生长增大，57 周时上腹部可扪及较明显的肿块，同一组荷瘤鼠肿瘤结节的大小略有差异。810 周时，上腹部肿块的直径可达 1.01.5 cm，大部分动物消瘦明显，活动欠佳。以后瘤体继续增大，腹部可
39、见巨大瘤体突起，动物极度消瘦、倦怠，对周围刺激反应差，逐渐出现全身衰竭和死亡。荷瘤鼠一般的生存时间为 1215周，中位生存期 13.5 周。2.2 大体解剖观察 打开腹腔去除胃周围组织可见（图 1）：看不到完整的胃壁，被肿瘤组织完全占据，表面呈结节状，高低不平，触及质地较硬，切面均质、鱼肉状，瘤体较大时中央有坏死区。胃壁肿瘤与网膜粘连，部分动物瘤体与肝、脾及腹壁粘连，大部分动物腹腔内淋巴结肿大（图 2），部分荷瘤鼠肝脏中见有灰白色结节，少数动物腹腔内有少量腹腔积液。2.3 光镜下观察 光镜下胃移植瘤细胞多呈椭圆形、核大、畸形、深染。瘤细胞排列呈巢状或索状，无明显腺体结构存在，在胃壁中呈浸润性生
40、长（图 3）。转移淋巴结内被癌细胞所充填，并破坏其组织结构，发展成转移癌结节（图 4）。肝转移癌灶的组织学形态结构与胃移植瘤相一致，多在肝实质的血管周围形成，部分转移癌灶的瘤细胞在肝组织中呈浸润性生长，且已经形成自身的较粗的血管系统（图 5）。2.4 透射电镜下观察 透射电镜下可见微绒毛突入细胞间隙，在许多紧密连接的细胞间能找到紧密连接、桥粒和缝隙连接。细胞内细胞器很丰富，以线粒体、粗面内质网、游离核糖体为多（图 6）。2.5 COX-2 表达情况 免疫组织化学染色结果表明：用人弥漫型胃癌细胞株 SGC-7901（低分化胃腺癌）细胞建立的人胃癌裸鼠原位移植瘤均高表达 COX-2，其阳性染色为棕
41、黄色，定位于细胞质，无胞核着色（图 7）。3 讨 论理想的胃癌裸小鼠人类肿瘤动物模型是研究肿瘤生长和转移生物学以及寻求抗癌新药和新方法的重要工具。这些模型必须能够很好地模拟人体内肿瘤的生物学行为。一个很好的胃癌动物模型应该具备肿瘤在局部呈浸润性生长、局部或远处有肿瘤转移以及微转移的存在的条件1。要建立能很好地模拟人类肿瘤恶性生物学行为的移植模型，必须使用具有转移潜能的瘤细胞，还必须让其在相应的器官环境中生长。既往的胃癌模型建立常规采用的方法为在裸小鼠皮下植入人肿瘤细胞，生长出来的肿瘤组织在形态、功能、生化特征等方面与人胃癌十分相似，但因其周围有结缔组织包裹，即便是选用高转移性的肿瘤也仅仅形成局
42、部肿瘤，限制了其浸润及转移2。以后的研究发现，移植瘤是否能够发生转移，不仅取决于瘤细胞本身的转移潜能，还决定于宿主器官对应的环境因素，裸鼠体内特定的解剖部位所提供的微环境对肿瘤细胞的生物学行为有重要的影响，而且肿瘤细胞和宿主微环境的相互影响对转移过程的完成起着举足轻重的作用3。1889 年 Paget 提出“种子与土壤”学说（seed and soil hypothesis），认为只有种子（瘤细胞）与土壤（患者器官微环境）相互作用才可能产生转移瘤。越来越多的学者认识到肿瘤生长和亲器官性转移位点的微环境对于转移链的各个环节均有不同程度的影响。因而提出建立人类肿瘤模型的原位移植（orthotopi
43、c transplantation）2：即将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植到动物体内相应的器官，使其获得与人体肿瘤相似的微环境。这一原位移植方式克服了上述所提到的异位移植存在的一些缺点。经过细致的观察发现：裸鼠的原位移植颇似临床肿瘤的生长和转移特点，但其生长速度、生长动力学和转移率高低各不相同，这可能取决于不同的肿瘤类型和细胞的生物学行为的不同2，4-6。Furukawa 等 4发现细胞悬液原位种植后，局部成瘤率和转移发生率较皮下移植块原位移植法低，且生长较皮下移植块法慢 23 周。本实验应用经裸鼠皮下反复传代的组织块移植于裸鼠胃壁，成功建立了 16 个人胃癌原位移植模型，并观察了小鼠的自然生长过
44、程。实验结果表明：皮下组织块原位移植建立的模型，局部成瘤率达 100，对濒临死亡的裸小鼠进行解剖观察发现，腹腔均发生广泛转移，且肝脏转移率达 75%。细胞悬液法可能是肿瘤细胞经酶消化处理后，细胞表面结构遭破坏而发生变化，导致了恶性肿瘤生物学行为和自然属性的改变，结果影响了肿瘤细胞的生长和转移4，5。皮下移植块原位移植的模型淋巴结转移较广泛，肝脏转移的发生率也较高。这可能是皮下传代的肿瘤细胞更能适应胃壁的生长环境，从而对其侵袭和转移等生物学行为的影响也最小，就如“在同样的土壤上原位移植块是最优秀的种子，就能结出最好的果实”。本实验的原位移植胃癌模型在光镜、电镜下超微结构的观察结果表明和人胃癌的特点很相似。 COX-2 在胃癌、结肠癌等消化道肿瘤中均有过度表达，并在肿瘤的发生、发展中起着重要作用7，8。本实验模型 COX-2 均高表达，很好地继承了人胃癌的生物学行为。因此，我们认为皮下移植块原位移植法具有成瘤率较高、淋巴结转移较广泛、肝脏转移发生率较高等特点，重现了人胃癌的临床病理和生理过程。该模型的建立为人胃癌转移机制与抗转移治疗的研究提供了一种有价值的工具。
