1、京都念慈庵蜜炼川贝枇杷膏限度检查操作方案一、 京都念慈庵蜜炼川贝枇杷膏简介二、 抽样三、 培养基的制备数量四、 方法学的验证试验五、 供试品的计数及限度检查微生物 03 班江 盈5 号京都念慈庵蜜炼川贝枇杷膏限度检查操作方案一、 京都念慈庵蜜炼川贝枇杷膏简介成份：川 贝 母 、枇 杷 叶 、南 沙 参 、茯 苓 、化橘 红 、桔 梗 、法半 夏 、五味 子 、 瓜 蒌 子 、款冬 花 、 远 志 、苦杏 仁 、生 姜 、甘 草 、杏仁水 、薄 荷 脑 ，辅料为：蜂 蜜 、麦 芽 糖 、糖 浆 。性状：本品为棕褐色稠厚的半流 体 ；具杏仁香 气，味甜 ，辛 凉。二、 抽样三、 培养基的制备数量培
2、养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。 1.营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基及改良马丁琼脂培养基照无菌检查法制备。 2.玫瑰红钠琼脂培养基 胨 5.0g 玫瑰红钠 0.0133g 葡萄糖 10.0g 琼脂 14.0g 磷酸二氢钾 1.0g 水 1000ml 硫酸镁 0.5g 除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄糖、玫瑰红钠，分装，灭菌。 3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD） 胨 10.0g 琼脂 14.0g 酵母浸出粉 5.0g 水 1000ml 葡萄糖 20
3、.0g 除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄糖，分装，灭菌。 4.胆盐乳糖培养基（BL） 胨 20.0g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5.0g 牛胆盐 2.0g 氯化钠 5.0g （或去氧胆酸钠） （0.5g） 磷酸氢二钾 4.0g 水 1000mL除乳糖、牛胆盐（或去氧胆酸钠）外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH值使灭菌后为 7.40.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐（或去氧胆酸钠） ，分装，灭菌。 5.乳糖胆盐发酵培养基 蛋白胨 20.0g 0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL 乳糖 10.0g 水 1000mL 牛胆盐 5.0g 除 0.04%溴甲酚紫水溶液外，取上
4、述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后为 7.40.2，加入 0.04%溴甲酚紫指示液，根据要求的用量分装于含倒管的试管中。灭菌。所用倒管的规格应保证产气结果6.曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB） 营养琼脂培养基 100ml 曙红钠指示液 2ml 20乳糖溶液 5ml 亚甲蓝指示液 1.31.6ml 取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至 60，按无菌操作加入灭菌的其他 3 种溶液，摇匀，倾注平皿。 7.麦康凯琼脂培养基（MacC） 胨 20.0g 1%中性红指示液 3ml 乳糖 10.0g 琼脂 14.0g 牛胆盐 5.0g 水 1000ml 氯化钠 5.0g 除乳糖、1%中性指示液、牛胆盐
5、及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后为 7.20.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约 60，倾注平皿。 8. 4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基 胨 10.0g 磷酸二氢钾（无水） 0.9g 硫酸锰 0.5mg 磷酸氢二钠（无水）6.2g 硫酸锌 0.5mg 亚硫酸钠 40mg 硫酸镁 0.1g 去氧胆酸钠 1.0g 氯化钠 5.0g MUG 75mg 氯化钙 50mg 水 1000ml 除 MUG 外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后为7.30.1，加入 MUG，溶解，每管分装 5ml，灭菌。 9.三糖铁琼脂培养
6、基（TSI） 胨 20.0g 硫酸亚铁 0.2g 牛肉浸出粉 5.0g 硫代硫酸钠 0.2g 乳糖 10.0g 0.2%酚磺酞指示液 12.5ml 蔗糖 10.0g 琼脂 12.0g 葡萄糖 1.0g 水 1000ml 氯化钠 5.0g 除三种糖、0.2%酚磺酞指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后为 7.30.1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，制成高底层（23cm）短斜面。 10.四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB） 胨 5.0g 硫代硫酸钠 30.0g 牛胆盐 1.0g 水 1000ml 碳酸钙 10.0g 取上述成分，混合，微温溶解，灭菌
7、。 临用前，取上述培养基，每 10ml 加入碘试液 0.2ml 和亮绿试液 0.1ml，混匀。11.沙门、志贺菌属琼脂培养基（SS ） 胨 5.0g 硫代硫酸钠 8.5g 牛肉浸出粉 5.0g 中性红指示液 2.5ml 乳糖 10.0g 亮绿试液 0.33ml 牛胆盐 8.5g 琼脂 16.0g 枸橼酸钠 8.5g 水 1000ml 枸橼酸铁铵 1.0g 除乳糖、中性红指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后为 7.20.1，滤过，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，灭菌，冷至 60，倾注平皿12.胆盐硫乳琼脂培养基（DHL） 胨 20.0g 枸橼酸钠 1.
8、0g 牛肉浸出粉 3.0g 枸橼酸铁铵 1.0g 乳糖 10.0g 中性红指示液 3ml 蔗糖 10.0g 琼脂 16.0g 去氧胆酸钠 1.0g 水 1000ml 硫代硫酸钠 2.3g 除糖、指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后为 7.20.1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余成分，摇匀，冷至 60，倾注平皿。 13.溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 胨 10.0g 溴化十六烷基三甲铵 0.3g 牛肉浸出粉 3.0g 琼脂 14.0g 氯化钠 5.0g 水 1000ml 除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后为 7.50.1，加入琼脂，加热溶化
9、后，分装，灭菌，冷至 60，倾注平皿。 14.亚碲酸盐肉汤培养基 临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每 100ml 中加入新配制的 1%亚碲酸钠（钾）试液 0.2ml，混匀，即得。 15.卵黄氯化钠琼脂培养基 胨 6.0g 10%氯化钠卵黄液 100ml 牛肉浸出粉 1.8g 琼脂 14.0g 氯化钠 30.0g 水 650ml 除 10%氯化钠卵黄液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后为 7.60.1，灭菌，待冷至约 60，以无菌操作加入 10%氯化钠卵黄液，充分振摇，倾注平皿。 10%氯化钠卵黄液的制备取新鲜鸡蛋 1 个，以无菌操作取出卵黄，放入 10%无菌氯化钠溶 16.
10、甘露醇氯化钠琼脂培养基 胨 10.0g 酚磺酞指示液 2.5ml 牛肉浸出粉 1.0g 琼脂 14.0g 甘露醇 10.0g 水 1000ml 氯化钠 75.0g 除甘露醇、酚磺酞指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH值使灭菌后为 7.40.2，加入琼脂，加热溶化后，滤过，分装，灭菌，冷至60，倾注平皿。 17.乳糖发酵培养基 胨 20.0g 0.04%溴甲酚紫指示液 25ml 乳糖 10.0g 水 1000ml 除 0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后为 7.20.2，加入指示液，分装于含倒管的小试管中，每管 3ml。灭菌。液 100
11、ml 中，充分振摇，即得。 18.绿脓菌素（Pyocyanin）测定用培养基（PDP 琼脂培养基） 胨 20.0g 甘油 10ml 氯化镁（无水） 1.4g 琼脂 14.0g 硫酸钾（无水） 10.0g 水 1000ml 取胨、氯化镁、硫酸钾和水混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后为 7.30.1，加入甘油及琼脂，加热溶化，混匀，分装于试管，灭菌，置成斜面。19.梭菌增菌培养基 牛肉浸出粉 10.0g 盐酸半胱氨酸 0.5g 胨 10.0g 氯化钠 5.0g 酵母浸出粉 3.0g 醋酸钠 3.0g 可溶淀粉 1.0g 琼脂 0.5g 葡萄糖 5.0g 水 1000mL 取上述成分，混合，加热
12、煮沸使溶解，调节 pH 值使灭菌后为 6.80.2，加热溶化，滤过，分装，灭菌。 20.哥伦比亚琼脂培养基 酪蛋白胰酶消化物 10.0g 肉胃酶消化物 5.0g 心胰酶消化物 3.0g 氯化钠 5.0g 玉米淀粉 1.0g 琼脂 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 水 1000ml 除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使灭菌后为 7.30.2，加入琼脂，加热溶化，滤过，分装，灭菌，冷至 4550，加入相当于 20mg庆大霉素的无菌硫酸庆大霉素，混匀，倾注平皿。 21. 沙氏葡萄糖液体培养基 葡萄糖 40g 水 1000ml 蛋白胨 10g 除葡萄糖外。取上述成分，混合，微温溶解，
13、滤过。加入葡萄糖，溶解，分装，灭菌。 22. 沙氏葡萄糖琼脂培养基 葡萄糖 40g 琼脂 1518g 蛋白胨 10g 水 1000ml 除琼脂和葡萄糖外。混合，微温溶解，滤过。加入琼脂和葡萄糖，溶解，分装，灭菌。 23. 念珠菌显色培养基(CHROMagar) 蛋白胨 10.2g 琼脂 15g 氢罂素 0.5g, 灭菌水 1000ml 色素 22.0g 除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值至 6.30.2。滤过，加入琼脂，加热煮沸,不断搅拌至琼脂完全溶解，倾注平皿。 24. 1%吐温 80-玉米琼脂培养基 黄色玉米粉 40g 琼脂 1015g 聚山梨酯 80 10ml 水 10
14、00ml 取玉米粉、吐温 80 及蒸馏水 500ml, 混合，65加热 30 分钟,混匀，用纱布滤过,补足原水量。取琼脂，水 500ml, 混合，加热溶解。将以上两种溶液混合，摇匀，分装，灭菌。 四、方法学的验证试验微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌素、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度 10000 级下的局部洁净度 100 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。
15、供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为 3035，霉菌、酵母菌培养温度为 2528，控制菌培养温度为 361。检验结果的报告以 1g、1ml、10g、10ml 或 10cm为单位报告。检验量检验量即一次试验所用的供试品（g、ml 或 cm）。除另有规定外，一般供试品的检验量为 10g 或 10ml；中药膜剂为50cm；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验应增加 10g 或 10ml。检验时，应从 2 个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于 4丸，膜剂还不
16、得少于 4 片。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的 3 倍量供试品。供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，可采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过 45。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过 1 小时。除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。1.液体供试品取供试品 10ml，加 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，混匀，作为 1：10 的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯 80 使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品 10g，加 PH7.0 无菌氯
17、化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为 1：10 的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯 80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。3.需用特殊供试液制备方法的供试品(1)非水溶性供试品 方法 1 取供试品 5g(5ml),加入含溶化的（温度不超过 45）5g司盘 80、3g 单硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯 80 无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入 45左右的 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为 1:20 的供试液。方法 2 取供试品 10g，加至含 20ml 无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录 XI
18、II B 无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中 ，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45的 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 100ml，振摇 510 分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为 1：10 的供试液。（2）膜剂供试品取供试品 100cm2，剪碎，加 50ml 或 100ml 的 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为 1：10 或 1：20 的供试液。(3)肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品 10g ，加 pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)PH7.6 无菌磷酸盐缓冲液（用于结
19、肠溶制剂）至 100ml，置 45水浴中，振摇，使溶解，作为 1：10 的供试液。（4）气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冰冻室冷冻约 1 小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯 80）中，混匀，取相当于 10g 或 10ml 的供试品，再稀释成 1：10 的供试液。（5）具抑菌活性的供试品当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下。培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量
20、的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液 2ml，每 1ml 供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每 1ml 供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为 1ml 的菌落数，计算每 1ml 供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。离心沉淀集菌法 取一定量的供试液，3000 转/分离心 20 分钟（供试液如有沉淀，先以 500 转/分离心 5 分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约 2ml，加稀释液补至原量。薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下
21、的“薄膜过滤法”。中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。细菌、霉菌及酵母计数计数方法的验证当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0 代），并采
22、用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌（Escherichia coli) CMCC（B）44 102金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)CMCC（B） 26 003枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis )CMCC（B） 63 501白色念珠菌 (Candidaalbicans)CMCC(F) 98 001 黑曲霉 (Aspergillus niger ) CMCC(F)98 003 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养 1824 小时；接种白色念株菌的新鲜培养物至
23、改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养 2448 小时。上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50100cfu 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养 57 天，加入 35ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数 50100cfu 的孢子悬液。验证方法 验证试验至少应进行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。（1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液 1ml 和501
24、00cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入 50100cfu试验菌，过虑，按薄膜过滤法测定其菌数。（2）菌液组 测定所加的试验菌数。（3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌 落计数方法测定供试品本底菌数。（4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每 1ml 供试液含 50100
25、cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。结果判断 在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于 70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于 70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于 70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。检查法计数
26、方法包括平皿法和 薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。取按验证的方法制备的均匀供试液，用 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成 1：10、1：100、1：1000 等稀释级。1.平皿法采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续 23 个稀释级的供试液。取供试液 1ml,置直径 90mm 的无菌平皿中，注入 1520ml 温度不超过 45的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备 2 个平板。阴性对照试验 取试验用的稀释液 1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养
27、。每种计数的培养基各制备 2 个平板，均不得有菌生长。培养和计数 除另有规定外，细菌培养 48 小时，逐日点计菌落数，一般以 48 小时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养 72 小时，逐日点计菌落数，一般以 72 小时的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至 57 天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于 15，则两个平板的菌落数不能相差 1 倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况
28、下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数较高的培养基中的菌数为计数结果。含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。菌数报告规则 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在 30300 之间、霉菌宜平均菌落数在 30100 之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。（1）当仅有 1 个稀释级的菌落数符合上述规定，以
29、该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。（2）当同时有 2 个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于 2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于 2 但不超过 5 时，以低稀释级的菌落乘以稀释倍数的值报告菌数，当出现比值大于 5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。（3）当各稀释级的平均菌落数均小于 30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。（4）如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的
30、平板有菌落生长，但平均菌落数小于 1 小时，以1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。2.薄膜过滤法采用薄膜过滤法，滤膜孔径不大于 0.45um，直径一般为 50mm。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为 100ml。每片滤膜的总过量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。取
31、相当于每张滤膜含 1g 或 1ml 供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品没 1g 或 1ml 所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液 1ml，过滤。用 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。阴性对照试验 取试验用的稀释液 1ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌 落数应超过 100 个。菌数报告规则 以相
32、当于 1g 或 1ml 供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌生长，以1 报告菌数（每张滤膜过滤 1g 或 1ml 供试品），或1 乘以稀释倍数的值报告菌数。控制菌检查控制菌检查方法的验证。当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。菌种 对试验菌种的要求同细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验
33、证。大肠埃希菌（Escherichia coli) CMCC（B）44 102金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)CMCC（B） 26 003乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B) CMCC（B）50 094铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC（B） 10 104生孢梭菌 (Clostridiumsporogenes) CMCC(B)64 941菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，
34、培养 1824 小时。用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数 为 10100cfu 的菌悬液。验证方法（1）试验组 取规定量供试液及 10100cfu 试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。（2）阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。结果判
35、断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。检查法供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。阳性对照试验 进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照验的加菌量为 10100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验 取稀释液 10ml 照相应控制菌检查法检查，作
36、为阴性对照。阴性对照应无菌生长。（1）大肠埃希菌（Escherichia coli) 取供试液 10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于 100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养 1824 小时，必要时可延长至 48 小时。取上述培养物 0.2ml，接种至含 5mlMUG 培养基的试管内，培养，于 5 小时、24 小时在 366nm 紫外线下观察，同时用未接种的 MUG 培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为 MUG 阳性，不呈现荧光，为 MUG 阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底
37、对照应为 MUG 阴性和靛基质阴性。如 MUG 阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如 MUG 阴性，靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如 MUG 阳性、靛基质阴性，或 MUG 阴性、靛基质阳性，均应取胆盐乳糖培养基的培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养 1824 小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表 1 所列的菌落形态特征不符，叛供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表 1 所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。表 1 大肠埃希菌菌落形态特征培养基 菌 落 形 态曙红亚甲蓝 呈紫黑色、
38、浅紫色、蓝紫色或粉红色、菌落中心呈琼脂 深紫色或无明显暗色中心、圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂 鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润（2）大肠菌群（Coliform) 取含适量（不少于 10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管 3 支，分别加入 1：10 的供试液 1ml（含供试品 0.1g 或 0.1ml）、1：100 的供试液 1ml （含供试品 0.01g 或 0.01ml ）、1：1000 的供试液1ml（含供试品 0.001g 或 0.001ml），另取 1 支胆盐乳糖发酵培养基加入稀释液 1ml 作为阴性对照管。培养 1
39、824 小时。胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养 1824 小时。若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表 2 所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表2 所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。表 2 大肠菌群落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂 呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润麦康凯琼脂 鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表
40、面光滑，湿润确证试验 从上述分离平板上挑选 45 个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养 2448 小时。若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。根据大肠菌群的检出管数，按表 3 报告 1g 或 1ml 供试品 中的大肠菌群数。表 3 可能的大肠菌群数表各供试品量的检出结果 可能的大肠菌群数 群数 N（个/g 或 ml）0.1g 或 0.01g 或 0.001g 或0.1ml 0.01ml 0.001ml+ + + 1000+ + 100 N 1000+ 10 N 100 N 10注：+代表检出大肠菌群； 代表未检出大肠菌群。（3）沙门菌（Salmonella） 取
41、供试品 10g 或 10ml，直接或处理后接种至适量（不少于 200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养 1824 小时。取上述培养物 1ml，接种于 10ml 四硫酸钠亮绿培养基中，培养 1824 小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚蓝琼脂）培养基的平板上，培养 1824 小时（必要时延长至4048 小时）。若平板上无菌生长，或生长的菌落不同于表 4 所列的特征，判供试品未检出沙门菌。若平板上生长的菌落与表 4 所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选 23 个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种
42、，培养 1824 小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。表 4 沙门菌菌落形态特征培养基 菌 落 形 态胆盐硫乳琼脂 无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色沙门、志贺菌属琼脂 无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色曙红亚甲蓝琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落麦康凯琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色（4）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 取供试液 10ml（相当于供试品 1
43、g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于 100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养 1824 小时。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养 1824 小时。铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板上的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选 23 个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养1824 小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴
44、加新配置的 1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在 30 秒内培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。绿脓菌素（Pyocyanin)试验 取斜面培养物接种于 PDP 琼脂培养基斜面上，培养 24 小时，加三氯甲烷 35ml 至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入 1mol/l 盐酸试液约 1ml,振摇后，静置片刻，观察。若盐酸容易呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的 PDP 琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验
45、应呈阴性。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。(5)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取供试液 10ml（相当于供试品 1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于 100ml）亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基中，培养 1824 小时，必要时可延长至48 小时。取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养 2472 小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表 5 所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。表 5 金黄色葡萄球菌菌落形态特
