1、青岛科标检测研究院 动物源食品中大环内酯类抗生素残留科标检测检测方法：微生物抑制法，适用于肉类、水产品、动物内脏、鸡蛋和牛奶中大环内酯类兽药筛选检测，阳性结果应用其他法进行确证。青岛科标检测为您提供抗生素残留检测，以下介绍的是标准 SN / T 1777.3-2008 的方法。1、试样制备和保存1.1 试样制备1.1.1 牛奶：取不少于 500试样，装入清洁容器内，进行标记。1.1.2 肉类、水产品、动物内脏：从原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放入高速组织捣碎机均质，充分混匀，用四分法缩分不少于 500试样。装入清洁容器内，进行标记。1.1.3 蛋：从原始样品中，随机分出一半（不少于
2、 500） ，鲜蛋需去壳，进行标记。注：制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。1.2 试样保存1.2.1 牛奶：04保存。1.2.2 肉类、水产品、动物内脏和蛋：试样于18以下保存。2、测定方法2.1 方法提要试样经压榨得到样液，样液加到含有一定数量的嗜热脂肪芽孢杆菌培养基中，64培养 34。利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试样中是否含有抗生素。2.2 设备和材料2.2.1 恒温箱：64。2.2.2 离心机。2.2.3 高速组织捣碎机。2.2.4 均质器。2.2.5 恒温水浴锅：。青岛科标检测研究院 2.2.6 涡旋振荡器。2.2.7 肉类榨汁器。2.2.8 克氏瓶。2.
3、2.9 安瓿。2.2.10 可调移液器：，。2.3 菌种和培养基2.3.1 菌种2.3.1.1 嗜热脂肪芽孢杆菌2.3.2 培养基2.3.2.1 细菌保存及传代培养基：见附录第.章。2.3.2.2 增菌固体培养基：见附录第.2 章。2.3.2.3 检定培养基：见附录第.3 章。2.4 试剂本标准所用化学试剂为分析纯，试验用水为蒸馏水、去离子水，试验用水应符合6682 的规定。2.4.1 指示剂：溴甲酚紫，制法见附录.3.2。2.4.2 甲醇。2.4.3 标准溶液：2.4.3.1 标准物质泰乐菌素：纯度。2.4.3.2 泰乐菌素标准储备液：100。称取标准物质泰乐菌素10.0（精确至 0.1）
4、，用甲醇溶解并定容至 100，得到终浓度为100的泰乐菌素标准储备液，置 28冰箱中保存，可使用个月。2.4.3.3 泰乐菌素标准工作液：.。吸取一定量的泰乐菌素标准储备液，用甲醇稀释成.的泰乐菌素标准工作液，置2冰箱中保存，可使用周。2.5 测定步骤2.5.1 样液制备青岛科标检测研究院 2.5.1.1 肉类、水产品、动物内脏：用肉类榨汁器榨汁，取大约 2汁液作为待测样液。2.5.1.2 蛋：取禽蛋液体至清洁容器中，均质后直接取样。2.5.1.3 牛奶：直接取样。2.5.2 菌悬液的制备一般情况下，菌种的传代次数不应超过代，否则在每次使用前确证其生化特性没有发生变异，或另需购置新的标准菌株。
5、在确定保存的菌种生化特性没有改变后，将复活的菌种分别接种于盛有增菌固体培养基的克氏瓶中，培养 72镜检芽孢数达以上（如果达不到，可再培养数日，芽孢数量仍达不到要求，菌种可能变异，不可使用） ，用灭菌生理盐水洗下菌苔，使其悬浮于生理盐水中，水浴加热 3，2犵离心2，弃上清液，用灭菌生理盐水重复洗涤芽孢两次。然后用灭菌生理盐水制成菌悬液，用稀释平板计数的方法或比浊法进行菌体计数以确定菌悬液的浓度，菌悬液中菌体细胞的含量应达到.。置 2冰箱保存，贮存期个月。2.5.3 检定安瓿的制备将嗜热脂肪芽孢杆菌菌悬液加入到融化后冷却至 6左右的灭菌检定培养基中，充分混匀，使培养基中嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到.
6、6。在灭菌安瓿中加入混合液，保持水平待其凝固。取制备好的检定安瓿，加入.泰乐菌素标准工作液，室温放置 2后，64培养 34，琼脂培养基颜色不变色，仍呈现紫色的安瓿为合格，达不到要求的安瓿应弃去。制备好的安瓿置 28冰箱可保存周。2.5.4 测定取制备好的检定安瓿，其中一个加入.泰乐菌素标准工作液作为阳性对照，一个加入阴性样品样液作为阴性对照。吸取待测样液加入检定安瓿中，将安瓿放置室温，20 预扩散；对于蛋、鱼、肾脏样品，预扩散后，需置于水浴加热。预扩青岛科标检测研究院 散后，用蒸馏水洗涤安瓿两次，洗去待测样液，去除安瓿内剩余的水，用铝箔纸封住安瓿口。将安瓿置于培养箱中，64培养 34，直到阴性
7、对照安瓿颜色变为黄色时停止培养。取出安瓿，根据安瓿内固体琼脂底部的三分之二部分的颜色判定结果。2.6 检测结果判断和报告如果待测样液安瓿内琼脂底部三分之二部分由紫色变为黄色，阳性对照安瓿内琼脂底部三分之二部分仍呈现紫色，即报告“阴性” 。如果待测样液安瓿和阳性对照安瓿内琼脂底部三分之二部分仍呈现紫色，即报告“初筛阳性” 。初筛阳性的样品可进一步用 内酰胺酶排除 内酰胺类药物，氨基苯酸排除磺胺类药物的可能（参见附录第.2 章） 。阳性样品需要用确证方法进行定性和定量分析。3、检测限检测限见表。表 检测限附 录 A（规范性附录）大环内酯类兽药 检测限（）泰乐菌素 50红霉素 50柱晶白霉素 50交
8、沙霉素 50螺旋霉素 50替米考星 50青岛科标检测研究院 培 养 基A. 细菌保存培养基A. 成分胰蛋白胨 .植物蛋白胨 .氯化钠 .琼脂 .蒸馏水 .A.2 制法将各成分加热溶解，分装试管，2高压灭菌，制成斜面。注：制成半固体时，琼脂量为.。A.2 增菌固体培养基A.2. 成分胰蛋白胨 .植物蛋白胨 .氯化钠 .磷酸氢二钾 .蒸馏水 琼脂 .A.2.2 制法将各成分加热溶解，分装于克氏瓶内，121高压灭菌。A.3 检定培养基A.3.1 成分牛肉膏 .大豆蛋白胨 .蛋白胨 .琼脂 .青岛科标检测研究院 蒸馏水 氯化钠 .磷酸氢二钾 .吐温 .溴甲酚紫 .葡萄糖 .A.3.2 制法.溴甲酚紫溶
9、液配制：称取.溴甲酚紫溶于蒸馏水中。将各成分加热溶解，分装每瓶，每瓶中加入.溴甲酚紫溶液，高压灭菌。附 录 B（资料性附录）菌种的理化性状测定和 内酰胺类、磺胺类药物的排除B. 菌种的理化性状测定定期对菌种进行理化性状测试，以确定菌种没有受到污染或变异。对性状改变的菌种，需购置新的 ATCC 菌种。测试的基本方法如下：将菌种ATCC10149 接种到传代培养基上，64培养后菌落黄色，鉴定结果见表.。表 B. 菌种 ATCC10149 生化反应项目 结果革兰氏染色镜检 酪素水解 淀粉水解 菌种精氨酸氨甲酰天冬氨酸 青岛科标检测研究院 脱水酶水解吲哚水解 明胶水解 卡巴肼水解 树胶醛醣 甘油水解 肝糖水解 菊粉 甘露醇水解 水杨苷水解 D海藻糖水解 卵磷脂 注：“ ” 表示阳性； “ ” 表示阴性。B.2 内酰胺类和磺胺类药物的排除对于初筛阳性的样品，加入 20内酰胺酶溶液（110 活性单位）到 230样液中，混匀后，吸取 100到检定安瓿中培养。如果测定结果为阴性，则样品中可能含有 内酰胺类药物。对于初筛阳性的样品，加入 p氨基苯酸溶液（）到 200样液中，混匀后，吸取 100到检定安瓿中培养。如果测定结果为阴性，则样品中可能含有磺胺类药物。
