1、单色荧光标记表达谱芯片实验流程一、准备 One-Color Spike Mix【根据上样量选择稀释步骤】1、 将 One-Color Spike Mix stock solution 在 vortex 上混匀，37 度处理 5 分钟，在vortex 上混匀，然后瞬时离心。2、 第一次稀释：在第一个管子上标注第一次稀释 spike-in，在 vortex 上混匀 spike mix，37 度循环水浴中加热 5 分钟，vortex 再次混匀，瞬时离心。在管子中加入 2 ul 的 spike mix。再加入 38 ul Dilution Buffer，vortex 混匀，瞬时离心。3、 第二次稀释：
2、在第二个管子上标注第二次稀释 spike-in，加入第一次稀释液 2 ul，再加入 48 ul Dilution Buffer， vortex 混匀，瞬时离心。4、 第三次稀释：在第三个管子上标注第三次稀释 spike-in，加入第二次稀释液 2 ul，再加入 38 ul Dilution Buffer， vortex 混匀，瞬时离心。5、 第四次稀释：在第四个管子上标注第四次稀释 spike-in，加入第三次稀释液 10 ul，再加入 30 ul Dilution Buffer，vortex 混匀，瞬时离心。保存：Store the Agilent RNA Spike- In Kit, On
3、e- Color at 70C to 80C in a non- defrosting freezer for up to 1 year from the date of receipt. The first dilution of the Agilent One- Color Spike Mix positive controls can be stored up to 2 months in a non- defrosting freezer at - 70C to - 80C and freeze/thawed up to eight times.二、探针标记1、 将 25-200 ng
4、 总 RNA 加入 1.5 ml 离心管中终体积 1.5 ul。 【RNA 保存要浓度大于100ng/ul，使用时再稀释】2、 每个管里加入 2 ul 稀释后的 spike mix，终体积 3.5 ul。3、 按照下表配制4、 每个管中加入 1.8 ul T7 Promoter Primer Mix，终体积 5.3 ul。5、 65 度水浴中 10 分钟，使引物和 RNA 变性。6、 冰上放置 5 分钟。7、 将 5X first strand buffer 于 80 度预热 3-4 分钟。Vortex 混匀，然后瞬时离心。室温放置待用。8、9、 按照上表配制 cDNA Master Mix。
5、10、 瞬时离心每个反应管，每管中加入 4.7 ul cDNA Master Mix，用枪混匀，终体积 10 ul。11、 将反应管在 40 度水浴中，放置 2 小时。12、 然后转入 70 度水浴中，放置 15 分钟。13、 然后冰上放置 5 分钟，瞬时离心。保存：如果想在此暂停实验，可以放置于-80 度保存。14、 按照下表配制 Transcription Master Mix15、 每反应管加入 6 ul Transcription Master Mix，用枪混匀，终体积 16 ul。16、 然后在 40 度水浴中处理 2 小时。保存：如果想在此暂停实验，可以放置于-80 度保存。三、纯
6、化探针【0.5h】1、 加 84 ul nuclease-free water 到 cRNA【标记后的探针 】中，总体积 100 ul。2、 加入 350 ul buffer RLT 然后用枪混匀。3、 加入 250 ul （96%-100%）乙醇，用枪混匀【此处不离心】 。4、 将总共 700 ul 体系转入 RNeasy mini column 中，13000 rpm，4 度离心 30 秒，弃滤过液。5、 将 RNeasy mini column 转入新的收集管中，加 500 ul RPE，13000 rpm，4 度离心30 秒，弃滤过液。6、 再加 500 ul RPE 到 RNeasy
7、 mini column，13000 rpm，4 度离心 60 秒，弃滤过液和收集管。7、 将 RNeasy mini column 转入新的收集管中，加入 30 ul RNase-free water，等 60秒后，13000 rpm，4 度离心 30 秒。冰上放置滤过液。8、 测定标记效率四、芯片杂交1、 按如下比例配杂交体系2、 60 度处理 30min，使 cRNA 片段化，然后迅速冰上处理 1 min。 【不要再这一步停留超过 30min。冰上放置或加入 2hybridization buffer 均可以终止fragmentation 过程】3、 按下表加入合适体积的 2GEx Hy
8、bridization Buffer HI-RPM【目的：终止片段化过程】4、 用枪混匀【不要用 vortex】 ，一定避免产生气泡。5、 13000 rpm 室温离心 1 min。6、 冰上放置，迅速将杂交液加到芯片上。7、 缓慢将杂交液加入 gasket 小室中。8、 将芯片 agilent 活性面朝下放到 gasket 上，夹紧 chamber。9、 65 度，10 rpm 杂交 17 小时。五、芯片洗涤1、 总体步骤如下2、 按照商标准备好洗缸，洗缸 1 和 2 中加入室温的 Wash Buffer 1，洗缸 3 中加入 37度预热的 Wash Buffer 2.3、 在洗缸 1 中打开 gasket 与 microarray，将芯片放入洗缸 2 中。4、 在洗缸 2，中速洗涤 1min。5、 然后迅速转入洗缸 3 中，中速洗涤 1min。6、 然后从洗缸 3 中缓慢拿出芯片。7、 进行芯片扫描。六、芯片扫描和数据提取1、 程老师实验室的扫描仪为 Agilent Scanner B。2、 按照如下设定扫描参数
