1、 微生物学实验指导黄文芳 张 松 编著华南师范大学生命科学学院第一部分 基础实验实验 1 培养基的配制一、实验目的和内容目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。内容：1牛肉膏蛋白陈培养基的配制。2高氏 1 号培养基的配制。3马丁氏培养基的配制。二、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO 3、NaCl、K 2HPO43H2O、MgSO 47H2O、FeSO 47H2O。试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。三、操作步骤（
2、一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，Nacl5g，琼脂 1520g，水 1000mL，PH7.47.61称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融
3、化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。3 调 pH 检测培养基的 pH，若 pH 偏酸，可滴加 lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸检测，直至达到所需 pH 范围。若偏碱，则用 lmol/L HCl 进行调节。pH 的调节通常放在加琼脂之前。应注意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。5分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培
4、养基约为试管高度的 l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。6加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉) 制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约 3/5 塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用 8 层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。7包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以 5 支或 7 支在一起，再于棉塞外包一层
5、牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。8灭菌 将上述培养基于 121.3湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应故人冰箱内暂存。9摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的 1/2。10无菌检查 将灭菌的培养基放入 37温箱中培养 2448h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。（二）高氏 l 号培养基的配制高氏 1 号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉 20g，KNO 3 1g，NaCl 0.5g，K 2HPO43H2O 0.5g，MgSO 47H2O 0
6、.5g，FeSO 47H2O 0.01g，琼脂 1520g，水 1000mL，pH7.47.6。 l称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分 FeSO47H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在 1000mL 中加入 1g 的 FeSO47H2O，配成浓度为 0.01g/mL 的贮备液，再在 1000mL 培养基中加入以上贮备液 1mL 即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养
7、基配制。2pH 调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。（三）马丁氏培养基的配制马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：K2HPO4 1g，MgSO 47H2O 0.5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 l0g，琼脂 1520g，水1000mL，自然 pH。1称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成 1%的水溶液，在 1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液 3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。2分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。3链霉素的加
8、入 链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45左右时才能加入。可先将链霉素配成 1%的溶液( 配好的链霉素溶液保存于 -20)，在100mL 培养基中加 1%链霉素 0.3mL ，使每毫升培养基中合链霉素 30g。四、注意事项称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调 pH 时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。五、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。六、问题和思考l配制培养基有哪几个步骤? 在操作过程中应注意些什么问题?为什么?2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的
9、培养基如何进行无菌检查?3试设计实验对饮料进行无菌检查。实验 2 消毒与灭菌一、干热灭菌（一）目的要求1了解干热灭菌的原理和应用范围。2学习干热灭菌的操作技术。（二）基本原理干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160170） ，时间要长（12h） ，但干热灭菌温度不能超过 180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的电烘箱的结构如图 2-1。图 2-1 电烘箱的外观和结构
10、A.外观 B.结构1.温度计; 2.排气阀; 3.箱体; 4.控温器旋钮; 5.箱门; 6.指示灯; 7.加热开关; 8.温度控制阀; 9.控制室; 10.侧门; 11.工作室; 12. 保温室; 13.电热器; 14. 散热板; 15.搁板（三）器材培养皿、试管、吸管、电烘箱等。（四）操作步骤1装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品（培养皿、试管，吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。2升温接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至 100时，关闭排气孔。在升温过程中，
11、如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的 160170温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。3恒温当温度升达到 160170时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度 2h。干热火菌过程。严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。4降温切断电源、自然降温。5开箱取物待电烘箱内温度降到 70以下后，打开箱门，取出灭菌物品。电烘箱内温度末降到 70，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。（五）实验报告思考题l在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么?2为什么干热火菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长?请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验
12、方案。二 高压蒸气灭菌（一）目的要求1了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。2学习高压蒸气灭菌的操作方法。（二）基本原理高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于 100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表 21） ，二是湿热的穿透力比干热大（表 22）
13、，三是湿热的蒸气有潜热存在。1g 水在 100时，由气态变为液态时可放出 2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。表 21 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含水量 /% 30 分钟内凝固所需温度/ 50 5625 748018 80906 1450 160170在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表23）表 2-2 干热温热穿透力及灭菌效果比较透过布层的
14、温度/温度/ 时间/h20 层 10 层 100 层灭菌干热 130-1404 86 72 70.5 不完全湿热 105.3 3 101 101 101 完全表 23 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系压力数Mpa Kg/cm2 Ib/in2全部空气排出时的温度/2/3 空气排出时的温度/1/2 空气排出时的温度/1/3 空气排出时的温度/空气全不排出时的温度/0.03 0.35 5 108.8 100 94 90 720.07 0.70 10 115.6 109 105 100 900.10 10.5 15 121.3 115 112 109 1000.14 1.40 20 126.
15、2 121 118 115 1090.17 1.75 25 130.0 126 124 121 1150.21 2.10 30 134.6 130 128 126 121现在法定压力单位己不用磅和 kg/cm2 表示，而是用 Pa 或 bar 表示，其换算关系为：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in 2=6894.76Pa.一般培养基用 0.1Mpa（相当于 15 Ib/in2 或 1.05kg/cm2） ，121.5,1530min 可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用 0.06Mpa（8Ib/in 2或 0.5
16、9kg/cm2）112.6灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以 0.1Mpa,121.5灭菌 20min 即可，而盛于大瓶内的培养基最好以 0.1Mpa，122灭菌 30min。实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式（图 2-2，A）和手提式（图 22，B）二种，其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸气灭菌锅为例，介绍其使用方法，有关自控高压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书。图 22A 卧式灭菌锅图 22B 手提式灭菌锅1. 安全阀; 2.压力表; 3.放气阀; 4.软管; 5.紧固螺栓; 6.灭菌桶; 7. 筛架; 8.水（三）器材牛肉
17、膏蛋白胨培养基，培养皿(6 套一包) ，手提式高压蒸气灭菌锅等。（四）操作步骤1首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。 切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。2放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压
18、力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 0.1Mpa，121.5，20min 灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。5灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。6将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入 37温箱
19、培养 24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。（五）实验报告l结果检查培养基灭菌是否彻底。2思考题（1）高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？（2）在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素?（3）灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?（4）黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强?为什么?三、紫外线灭菌（一）目的要求了解紫外线灭菌的原理和方法（二）基本原理紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为 200300nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm 的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时
20、间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和 DNA 链的交联，从而抑制了 DNA 的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O ，再使 O2 氧化生成臭氧（O 3）或使水（H 2O）氧化生成过氧化氢（H 2O2） 。O 3 和 H2O2 均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过 1.2m 为宜。此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前；可在无菌室内(或接种箱内) 喷洒 3% 5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可
21、用 2%3% 的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。（三）器材1培养基 牛肉膏蛋白胨平板。2溶液或试剂 3%5%石炭酸或 2%3%来苏尔溶液。3仪器或其他用具 紫外线灯。（四）操作步骤l单用紫外线照射（1）在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射 30min，将开关关闭。（2）将牛肉膏蛋白胨平板盖打开 15min，然后盖上皿盖。置 37培养 24h。共做三套。（3）检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过 4 个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。2化学消毒剂与紫外线照射结合使用（1）在无菌室内，先喷洒 3%5% 的石炭酸溶液，再用紫外线灯
22、照射 15imn。 （2）无菌室内的桌面，凳子用 2%3% 来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射 15min。（3）检查灭菌效果方法同 “单用紫外线照射”(3)。因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光下工作。（五）实验报告1结果记录两种灭菌效果于下表中处理方法 平板菌落数1 2 3灭菌效果比较紫外线照射3%5%石炭酸+紫外线照射2%3%来苏尔+紫外线照射 2思考题。（1）细菌营养体细胞和细菌芽孢对紫外线和的抵抗力会一样吗，为什么？（2）你知道紫外线灯管是用什么玻璃制作的？为什么不用普通灯用玻璃？（3）在紫外灯下观察实验结果时，为什么要隔一块普通玻璃？四 微孔滤膜过
23、滤除菌（一）目的要求1了解过滤除菌的原理。2掌握微孔滤膜过滤除菌的方法。（二）基本原理过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，人口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。（三）器材1培养基 2%的葡萄糖溶
24、液，肉汤蛋白胨平板。2仪器或其他用具 注射器，微孔滤膜过滤器，0.22m 滤膜，无菌试管，镊子，玻璃刮棒。（四）操作步骤l组装、灭菌将 0.22m 孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌后待用(0.lMPa，121.5灭菌 20min)。2连接将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。见图 23。3压滤将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拨出。 压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过淀胶4无菌检查无菌操作吸取除菌滤液 0.1ml 于肉汤蛋白胨平
25、板上，涂布均匀，置 37温室中培养24h，检查是否有菌生长。5清洗弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，组装包扎，再经无菌后使用。整个过程应在无菌条件下严格无菌操作，以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗漏现象。（五）实验报告l结果记录无菌检查结果2思考题(1)你做的过滤除菌实验效果如何?如果经培养检查有杂菌生长，你认为是什么原因造成的?(2)如果你需要配制一种含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培养基，其抗生素的终浓度( 或工作浓度) 为 50g/ml，你将如何操作 ?(3)过滤除菌应注意哪些问题? 实验 3 土壤的稀释分离、纯化微生物及无菌操作技术一、实验目的和内容目的
26、：学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。内容：l用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。2用平板划线方法分离微生物。3学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。二、实验材料和用具金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通变形菌(Proteus vulgaris )斜面菌种。已灭菌的牛肉膏、高氏 1 号、土豆蔗糖固体培养基各 1 瓶，49.5mL 无菌水(带玻璃珠)1 瓶，4.5mL 无菌水 6 管，80% 乳酸，10%酚液，95% 乙醇。无菌培养皿 12 套，1mL 无菌移液管 10 支，土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头( 用 75%乙醇浸泡)、玻璃
27、刮。三、操作步骤(一)土壤稀释分离1取土壤 取表层以下 510cm 处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在 4冰箱中暂存。2制备稀释液(要无菌操作)(1)制备土壤悬液：称土样 0.5g，迅速倒入带玻璃珠的 49.5mL 无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好) ，振荡 5 10min，使土样充分打散，即成为 10-2 的土壤悬液。(2)稀释：用无菌移液管吸 10-2 的土壤悬液 0.5mL，放入 4.5mL 无菌水中即为 10-3 稀释液，如此重复，可依次制成 10-310 -8 的稀释液(图 3-1)。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面
28、，吹吸 3 次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。图 31 稀释法分离土壤微生物操作过程图解3. 混菌法测定菌落数的方法(1)细菌：取 10-7、10 -6 两管稀释液各 1mL，分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至 50的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高 1.52mm 为宜) ，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意无菌操作，见图 3-2。图 32 倒平板的方法（2）放线菌：取 10-5、10 -4 两管稀释液，在每管中加入 10%酚液 56 滴，摇匀，静置片刻，然后分别
29、从两管中吸出 1mL 加入相应标号的平皿中，选用高氏 1 号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。（3）霉菌：取 10-2、10 -3 两管稀释各 1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。在融化的土豆蔗糖培养基中，每 100mL 加入灭菌的乳酸 1mL，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。4培养 将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于 2830中恒温培养，细菌培养 12d，放线菌培养 57d，霉菌培养 35d。观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。（二）平板制作及划线分离方法。1倒平板 按无菌操作要求
30、，在火焰旁操作（图 32） ，做法如 3（1） 。2划线分离 使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落，主要方法参见图33。图 33 平板划线方法示意图A. 划线分离操作 ; B.用于稀释液中, 可连接划线;C. 用于较浓的菌样, 分数次划线, 每次划线后要烧接种环, 然后再划下一区。3培养 方法同“土壤稀释分离” 。（三）斜面接种和穿刺接种1斜面接种（1）取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等） ，然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上。（2）接种的方法是，用接种环沾取
31、少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部（图 34A） 。注意划线要轻，不可把培养基划破。图 34 斜面接种（A ）及穿刺接种（B）示意图（3）接种后 30 恒温培养，细菌培养 48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。2穿刺接种（1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记（写上菌名） 、接种日期，接种人等） 。（2）接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底部（但不要穿透） ，然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。（3）接种后 30恒温培养， 24h 后观察，比较两种菌的生长结果。四、注意事项1一般土壤
32、中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。2在土壤稀释分离操作中，每稀释 10 倍，最好更换一次移液管，使计数准确。3放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。五、实验报告1记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量。计算方法：选择长出菌落数 30300 之间的培养皿进行计数，按以下公式：总菌数/g=同一稀释度几次重复的菌落平均数稀释倍数2分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价。3比较两种细菌穿刺接种的结果，并进行分析。七、问题和思考1在测定土壤微生物含量中，除混
33、菌法外还可用什么方法?2试设计实验，从土壤中分离出酵母菌，并进行计数。实验 4 微生物菌落的观察一、实验目的和内容目的：识别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌四大类微生物的菌落特征。内容： 1观察已知菌的菌落的形态、大小、色泽、透明度、致密度和边缘等特征。2根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。二、实验材料和用具大肠杆菌(E.coli )、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、粘红酵母( Rhodotorula gracitis)、热带假丝酵母(Candida tr
34、opicalis)、细黄链霉菌(Streptomyces microflavus，又称 “5406”抗生菌) 、灰色链霉菌( Streptomyces griseus )、黑曲霉( Aspergillus niger )、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、球孢白伍菌( Beauveria bassiana)等细菌的斜面菌种。牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基、高氏 1 号培养基、无菌水。接种环、接种针、酒精灯、无菌培养皿多套、电热恒温箱。三、操作步骤(一)制备已知菌的单菌落1制备平板 将已融化的无菌培养基待冷却至 50左右，分别制备牛肉膏蛋白胨培养基平板、马铃薯蔗糖培养
35、基平板和高氏 1 号培养基平板各一皿。2制备菌悬液或孢子悬液 在培养好的斜面菌种管内加入 5mL 无菌水，制成菌悬液后备用。3制备单菌落 通过平板划线法获得细菌、酵母菌和放线菌的单菌落。用三点接种法获得霉菌的单菌落。细菌于 37恒温培养 2448h，酵母菌于 28培养 23d，霉菌和放线菌置 28培养 57d，待长成菌落后，仔细观察四大类微生物菌落的形态特征，并将观察结果记录于表 4-1 中。(二)制备未知菌落l倒平板2接种 可用弹土法接种，其要点为：采集校园土壤，待风干磨碎后，可将细土撒在无菌的硬板纸表面，先弹去纸面浮土，然后打开皿盖，便含土的纸面对着平板培养基的表面，用手指在硬板纸背面轻轻
36、一弹即可接种上各种微生物。3培养 将牛肉膏蛋白胨培养基平板倒置于 37培养箱中恒温培养 23d，将马铃薯蔗糖培养基倒置于 28培养箱中恒温培养 35d，即可获得未知菌的单菌落。4编号 从培养好的未知平板中，挑选 8 个不同的单菌落，逐个编号，根据菌落识别要点区分未知菌落类群，并将判断结果填入表 42 中。(三)直接观察菌落直接用实验 3 中的“土壤稀释分离”获得的单菌落进行观察识别，并将结果填入表 4-2 中。四、注意事项观察菌落特点时，要选择分离得很开的单个较大菌落；已知菌落和未知菌落要编好号，请勿随意移动开盖，以免搞混菌号。五、实验报告1已知菌落的形态特征记录于表 41 中。2将未知菌落的
37、辨别结果记录于表 42 中。七、问题和思考1试比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌菌落形态的差异?2设计一个实验，检测实验室空气环境中的微生物类别?表 41 已知菌菌落的形态辩别要点 菌落描述湿 干 颜色微类生物数菌名厚薄大小松密大小表面边缘隆起形状 正面反面水溶性色素透明度大肠杆菌金黄色葡萄球菌细菌枯草杆菌酿酒酵母粘红酵母酵母菌热带假丝酵母细黄链霉菌放线菌灰色链霉菌霉菌 产黄青霉黑曲霉 球孢白僵菌表 42 未知菌菌落的形态湿 干 菌落描述颜色判断结果菌落号厚薄大小松密大小表面边缘隆起形状 正面反面水溶性色素透明度1 21 2 3 4 5 6 7 8 注：四大类微生物菌落的识别要点如下：大而扁平小小
38、而扁平 细菌大而扁平湿润：正反面颜色一致 大大而隆起酵母菌小 小而致密大而致密菌落 干燥，正反面，中央与边缘颜色不一致 大 大而疏松 霉菌实验 5 显微镜油浸系物镜的使用一、实验目的和内容目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。内容：1学习油浸系物镜的使用方法。2用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。二、实验材料和用具枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)、金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)的染色装片。香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。三、操作步骤(一)观察前的准备1将显微镜置于平稳的实验台
39、上，镜座距实验台边沿约为 4cm。坐正，练习用左眼观察。2调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约 1mm 左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。(二)低倍镜观察染色装片首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片 0.5cm 处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升( 或使镜台下降 )至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片
40、，把合适的观察部位移至视野中心。(三)高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。(四)油镜观察1提起镜筒约 2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方) 滴一滴香柏油。2从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。3将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转) ，当视野中有物像
41、出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。4再次观察 提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。(五)镜检完毕后的工作1移开物镜镜头。2取出装片。3清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。4擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中
42、，置阴凉干燥处存放。四、注意事项1使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察2下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。3使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。4注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。五、实验报告分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率。六、问题和思考1用油镜便于观察细菌的依据是什么？2使用油镜应特别注意哪些问题？3当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求
43、？应如何调节？油镜的基本原理（一）油镜头的辨认油镜头上常刻有 OI(oil immersion)或 HI（homogeneneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜 3 物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短（图 51）图 51 显微镜物镜参数示意图（二）显微镜的分辨率显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它分辩率的大小。分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。 D 值愈小表明分辨率愈高。 D 值与光线的波长（）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比。从上式可
44、看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积；影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n= 1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角（图 52A） 。当以香柏油（n=1.515 ）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射（图 52B） ，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为 0.55m。当使用数
45、值孔径为 0.65 的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为 0.42m ；而使用数值孔径为 1.25 的油镜时，能辨别两点之间的距离则为 0.22m。NA22sinNA图 52 介质为空气（A ）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较实验 6 细菌形态的观察一、实验目的和内容目的：巩固油镜的使用；掌握细菌形态观察的基本方法，了解细菌的基本形态。内容：1观察细菌的基本形态染色装片。2观察枯草芽孢杆菌活菌。3观察细菌细胞结构的染色装片。二、实验材料和用具溶血链球菌(Streptococcus haemolyticus )、棒杆菌(Corymebacterium )、螺菌(Spirillum) 、浮游球
46、衣菌(Sphaerotilus natans)、巨大芽孢杆菌( Bacillus megaterium )、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis )、普通变形菌( Proteus vulgaris)、丙酮丁醇梭菌(Clostridum acetotylicum)、褐球固氮菌( Azotobacter chroococcum )等细菌的染色装片，枯草芽泡杆菌(Bacillus subis)的斜面菌种。香柏油、二甲苯、无菌水；显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸水纸、小滴管。三、操作步骤(一)观察细菌的基本形态用低倍镜、高倍镜和油镜观察溶血链球菌、棒杆菌、螺菌
47、、浮游球衣菌的染色装片，并分别在油镜下绘图。(二)观察细菌的细胞结构用低倍镜、高倍镜和油镜观察巨大芽孢杆菌(示细胞壁) 、巨大芽孢杆菌 (示异染粒)、苏云金芽孢杆菌(示伴胞晶体) 、普通变形菌(示鞭毛) 、丙酮丁醇梭菌 (示芽孢)、褐球固氮菌(示荚膜) 等细菌的染色装片，并分别在油镜下绘图。(三)观察枯草杆菌活菌，常用压滴法观察。 1将洁净无油腻的载片放于自己右边前方，在中央放一小滴无菌水。2将酒精灯放于自己正前方，点燃。3用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。4用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻
48、片慢慢放下，注意不要产生气泡。如菌液过多，可用吸水纸适当吸去一部分。5先用低倍镜然后转用高倍镜观察，观察时光线要适当调暗些。四、注意事项1注意擦镜头时，只能用擦镜纸。2，观察完毕，必须将镜筒上升，才能取下装片，放入另一装片后，要按使用油镜要求，重新操作，不能在油镜下直接取下和替换装片，切记！3无菌操作过程中，接种环灭菌后不能触及其他物品，挑菌不能过多。五、实验报告(一)绘图l给出你所观察到的几种细菌的个体形态视野图。2给出你所观察到的细菌细胞结构视野图，并注明各部分。(二)试指出在制备活菌装片时，应注意什么问题?七、问题和思考1用明视野显微镜观察细菌的形态时，你认为用染色装片好，还是用非染色的活体装片好，为什么? 观察活体装片与染色装片，光线调节各有什么不同?2无菌操作过程中，可否将棉塞放在桌面上?为什么?3 试设计一个准备本实验的工作方案。实验 7 细菌单染色法及口腔微生物的观察一、实验目的和内容目的：巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片和单染色技术，了解口腔中的微生物及其观察方法。内容：1.学习细菌单染色操作技术。2. 用单染色法或负染色法观察口腔中的微生物。二、实验材料和用具大肠杆菌(E.coli )、金黄色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus) 的斜面菌种。吕氏美蓝
