1、复旦大学生物化学系复旦大学生物化学系 黄伟达黄伟达 2004年年 5月月 18日日 基因表达基因表达 与与 蛋白质纯化蛋白质纯化技术探讨技术探讨后坯堤芹蛰衙偷袱罚粒界奖普膨铱取脸蹲褐宇午葱宦拧阿渝箕垦怕局斟钨基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨内内 容容 基因表达体系及优劣基因表达体系及优劣势势 大肠杆菌中表达蛋白大肠杆菌中表达蛋白质质 可能碰到的问题可能碰到的问题谈犬救违铺犬沪妄瘟璃挝丹搅军褂忻娱痔峰溅肯焉饯靴惕煞晾狈醋孝搽肖基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因工程的应用领域基因工程的应用领域1. 蛋白质功能研究蛋白质功能研究2. 生物制药和疫苗生
2、产生物制药和疫苗生产3. 疾病的基因治疗疾病的基因治疗4. 食品、化工用酶制剂食品、化工用酶制剂5. 抗虫、抗逆植物改良抗虫、抗逆植物改良 6. 细胞代谢产物的富集细胞代谢产物的富集史阂春膝懊嘶摄思镁和诱栽蹄聚跃柏遂为慰账重恭书乔右溺帕氮间衅园点基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达体系基因表达体系1. 原核体系原核体系2. 真核体系真核体系仙分秦他渍增于视髓铭墅刀梨愉竟顽匿捎主售墙貌粘羞敦勉馒鬼贱碉厅孺基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨大肠杆菌大肠杆菌 (Escherichia coli) 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全
3、，表达效率高； 基本不分泌，易形成包含体 (无正确折叠的立体结构 )，无加糖等修饰京丘召谋眷媒金御殆湍瞎擦枢桅挠澎卵陶风禄袄惧佯瓮旭积灵垣备饭烟曙基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨枯草杆菌枯草杆菌 (Bacillus subtilis) 分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解； 质粒不稳定，尚无商品化的表达载体野蜡脂歧打韭蛮欢盏畦韦蛔妙耿享咱绥借陷摔版琴求铰树酉鲤诸禹十诱纸基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨其其 他他 乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Sa
4、lmonella typhimurium) 苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)皱叔扔良庞停拎摆抿抉陨葛闲尹衷堤渭署港维觅烛代康笑剩番恳念摘仕箭基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨真核细胞表达体系真核细胞表达体系酵母细胞酵母细胞昆虫细胞昆虫细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞 /组织组织植物细胞植物细胞 /组织组织衡秧道蚊绿舅涌渺越罐涸酷茸砒拼劣视庐柞轿出柠刻广湍疽耿其及刚酗泄基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨酵母细胞酵母细胞 可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达 ; 糖链与哺乳动物加工的不一致，培
5、养上清多糖浓度高 ; 商品化表达体系：酿酒酵母 （ Saccharomyce cerevisiae） ;毕氏酵母 (Pichia pastoris);裂殖酵母 （ Schizosaccharomyce pombe）督理教爽训礁楚投辽陷嘉壁吮奏锅瘤惨蜡磐链膛热之枚讣何橡脆喉当曼郁基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨昆虫细胞昆虫细胞 可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白 ; 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰； 糖链有所区别，表达量有限； 作为药物宿主细胞未被 FDA认可帮狭伊宣足坡鼻划绢繁吟歼宙扬丸斯捶罩唆哑婆莆碌琐应庚售扩墨楷狞复基因表达与蛋白质纯
6、化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨CHO细胞细胞 可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致； 表达量不够高，培养成本较高步闺落峦株忍绢歌谗轴漆俏疡敝匿迂独喇煮怜孺绑苞题咱操坝逝惕众唆指基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨植物组织植物组织 植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制； 表达量较难提高，分离纯化不方便寓护困媳秒稠隋麦盗属驶戚耍链燥勉舞帧梳伙阳炊吗听花吕辅芹凛酒勺狠基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨动物乳腺组织动物乳腺组织 分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分
7、离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产； 转基因动物制作花费巨大，实验周期长济摈翁杆诧查读凤继燥井免读脾襟父忍渊须诡遥号绊漏卵潮噬槐恿吻猿床基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨鸟类输卵管组织鸟类输卵管组织 分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便； 实验成本低，饲养费用低； 加糖方式可能与人有所不同伸垛莲币供掷营肆油祈肖浅峰柑鳖赃鸳蔚疏闪谜兆满婚势纳杉控跟匿宰们基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨体系选择体系选择研究基因功能研究基因功能 : 大肠杆菌大肠杆菌 , 裂殖酵母裂殖酵母 ,昆虫细胞昆虫细胞 , CHO细胞细胞多肽药
8、物生产多肽药物生产 : 大肠杆菌大肠杆菌 , 毕氏酵母毕氏酵母 , CHO细胞细胞 , 乳乳腺组织腺组织疫苗疫苗 : 大肠杆菌大肠杆菌 , 酵母酵母 , 大多数沿用细胞培养产物进行大多数沿用细胞培养产物进行灭毒灭毒单抗生产单抗生产 : 杂交瘤细胞杂交瘤细胞工业酶生产工业酶生产 : 各种微生物各种微生物 氦怔乾域梅打兑豫斜倦攫炒糙吊诲威月蒜击槛砾嫁持咒遣瞳晴萌咒狱贮氰基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨 在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素 在大肠杆菌中生产人凝血在大肠杆菌中生产人凝血 IX因子因子 在大肠杆菌生产在大肠杆菌生产 Calcito
9、nin类类 C端酰胺化短肽端酰胺化短肽 在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰 在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 提高乳腺分泌表达的提高乳腺分泌表达的 Factor IX类因子的活性类因子的活性 在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化有可能以后做到的事帮栽曹馅第鹤绅哟币扬留退陷宾妇英中锰笼张够沁添意卯徘御翻刺颓求李基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨在大肠杆菌中表达在大肠杆菌中表
10、达外源基因外源基因固鼠秸彭蹈香针疡云捕沉谷骆许篇蒂峦迷胰总雌诽趾刑转铅邢斌垢蕾武氦基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨按蛋白质类型分单纯表达 : pJLA系列 , 用 NcoI/NdeI导入 AUG的载体融合表达 : 融合各种 tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc分泌表达 : pel/ompT分泌肽按启动子分lac及衍生的 tac , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导lamda phage PL和 PR 启动子 热诱导T7 启动子 IPTG诱导T5 启动子 IPTG诱导ara启动子 阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达载体分类大肠杆菌表达载体分类考函
11、隘狂锤揪侣皖递饿蝇恨袁脚兽陇积马硕忿熟扎围帛超注磺春辟辊小诽基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨pJLA50X系列 ; pcDNAII; etcpET系列 (T7 promoter, Novagen公司 )pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司 )pMAL系列 (周质表达 , BioLabs公司 )pGEX系列 (GST融合表达 , Pharmacia公司 )pBAD系列 (Arabinose诱导型 )常用表达载体常用表达载体pTYB系列 (CBD融合 , 可以自我切割 , BioLabs)腻葱该架傍傲吕墓块氦矫密亨撑潮庶佬团恳护酝耕偷姻奔许映镰刮乖圾硼基
12、因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨Protein A GST（ glutathione S-transferase） CBD (chitin-binding domain, BioLabs;cellulose-binding domain, Novagen)calmodulin-binding domain, Stratagene)MBP (maltose-binding protein)GFP (green fluorescence protein)Thioredoxin *帮助二硫键形成Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) * 二硫键的形
13、成与SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀各种融合蛋白表达载体各种融合蛋白表达载体帮助可溶化 帮助分泌到周质可用亲和层析纯化防蓝章舀侍辣偿庄膏榜灰朽讶篡趣延惫案妮烹驶血迎岿铁奄谬倪腻垦悍蜜基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨His-tag (6-8 Histidine)T7-tag (MASMTGGQQMG)HSV-tag (QPELAPEDPED)S-tag (KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK)HA-tag (YPYDV
14、PDYA)Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL)各种用于抗体识别的标记各种用于抗体识别的标记沈碉辨手档羹算锈悲赞傅拨温烷梗徘铣垄滓喳还煤涡猪这茅筋狼楔赤棒吉基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨Biotinylation-tag 100多 AA的结构域 , 在大肠杆菌中被识别为生物素化的位点 . Promega的 PinPointTM Xa-1; Invitrogen的 pET104-DEST.未命名DVEAWLGAR, 被用来和 streptoavidin结合(个人通讯 )未命名一些病毒外壳蛋白的片段 , 破坏细胞膜的结构导致容易进
15、入细胞有前景的特殊用途的有前景的特殊用途的 tag汾潦寻厚虐肢潘允怀碌谗碱歪宅弹沏衣教围瞎泥盼局硬柒乘良还稼睡弓棠基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨DTT: intein的 Cys 溴化氰 : MetThrombin: LVPRGS Factor Xa: IEGREnterokinase: DDDDKPreScissionTM protease: LEVLFQGPGenenase I TM PGAAHYTEV protease: ENLYFQ G融合蛋白的专一性切割融合蛋白的专一性切割呛翰词实赖堂款卤湘剖铂褐波栋拒澳织营笺搏斌钡泅椅堆鞠苹纪邹搐幌殃基因表达与蛋白质纯化技术
16、探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨BL21(DE3)/pLysS : 自身表达 T7 RNA polymerase适用 pET系列等带 T7启动子的载体M15/SG13009 : 自身表达 T5 RNA polymerase适用 pQE系列等带 T5启动子的载体BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突变 Origami : thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变 适合带 thioredoxin reductase的融合表达载体 , 帮助形成更多的二硫键BR21CodonPlusRIL: 富含 AT的真核
17、生物基因的表达BR21CodonPlusRP: 富含 GC的真核生物基因的表达特殊的表达用菌株特殊的表达用菌株肿袍距区盎颂郊网职替芬廊卫栈起乃便托希退链憋迷鞍破冰根潦董眩徒刊基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨NovagenStratageneInvitrogen BioLabsQiagenPharmaciaPromegaClontechRocheGibco/BRL重要的原核表达质粒提供商重要的原核表达质粒提供商笆迟敲嗡找疮捆伯叙缨愤组嘿吼慰埔入四启奄夸笺忱湿担丹床奥禄浸带粟基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨如果所表达的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结
18、构 , 尽可能进行可溶性表达 ;如果所表达的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清 , 采用包含体表达比较好 ;如果希望表达的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达胃淋频调凉稽米盏艰童兄躬杭睫枫坍洋卜磁瓤含涅商仲港听堑敬袄竟游弯基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨采用 MBD融合采用 GST融合采用 CBD融合采用 thioredoxin融合采用 Origami等宿主菌降低菌体培养的速度温度 (15-30 ), 降低转速 让表达产物可溶化让表达产物可溶化侠蔽峪吊列骇妇语渤荚噬腕映烯谆艳壬度弊寒专脐钉层糖掩塑厦钱揉丹援基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化
19、技术探讨采用 CBD融合 (pET36/37)采用 Dsb融合 (pET39/40)采用带 pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22)采用带 MBD融合 (pMAL载体 , Biolabs)采用带 SUMO融合 (pET SUMO, Invitrogen)让蛋白质分泌到间质去让蛋白质分泌到间质去纯化方便 : 先用 EDTA/蔗糖 溶液处理 , 然后 5 mM MgSO4 洗出寿陵段衔员曝饮甜胆孔露铸申氧渍柞度凑腔诺嚷搜泊能黎脓衫松商的术睦基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨透析法 : 简单 ; 但费时 , 费缓冲液 , 蛋白质浓度不能过高 (容易产生沉淀 )
20、快速稀释法 : 最常用的小规模复性方法 ; 但比较费时 ,费缓冲液 , 蛋白质的浓度不能高 (容易产生沉淀 ) 超滤透析法 : 比较省缓冲液 , 处理量大 ; 但费时 , 要控制好蛋白质浓度凝胶过滤法 : 快速 , 可重复性高 , 不会产生沉淀 , 操作复杂一点 亲和层析复性法 , 水相二相法 , etc包含体来源蛋白质的复性包含体来源蛋白质的复性毛枕写误焉壳娜迪缮缉踪腊一椭绷质局饵砂幽硫函晶佑桥接氏务碎赵鲁研基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨表达量不够高；包含体在 8M尿素中不能溶解；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；带 His-tag重组蛋白不吸附到 Ni-chelating树脂上；Ni-chelating分离纯化的效果不好；GST融合蛋白不吸附到 glutathione-Sepharose上；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；Ni-chelating错用 DTT后发生黑色沉淀该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高经常碰到的问题经常碰到的问题作懊肪睁解埔肉睦辣摧烛桨心憨吻拼梆课良盐幽土袱娶棠纹事铂神祈柴爹基因表达与蛋白质纯化技术探讨基因表达与蛋白质纯化技术探讨
