饲喂抗生素对猪肠道内微生物群系的影响.doc

1、In-feed antibiotic effects on the swineintestinal microbiome饲喂抗生素对猪肠道内微生物群系的影响周勇（译）摘要：抗生素在农业型动物上的使用已有超过 50 年的历史，其有助于对动物疾病治疗、疾病预防以及促进其生长。然而这类抗生素的应用对人类疾病治疗的影响是一个激烈争论的话题。本实验在高度控制的环境条件下对猪进行饲养试验，同一窝猪仔选择一部分饲喂含有高性能抗生素（金霉素、磺胺甲嘧啶和青霉素，被称为 asp250）的饲料，另一部分用不添加抗生素的相同的饲料饲喂。我们采用系统发育学，基因组分析，以及定量 PCR 的方法，来处理抗生素对猪肠道微

2、生物的影响结果。14 天后添加抗生素处理的菌群类型发生转变，饲喂药物的猪肠道内的有益菌的数量比不含药物的增加（1-11%） 。这种转变是由于大肠杆菌的数量增加。宏基因组的分析表明，在饲喂抗生素的猪体内，微生物所含有的与能量产生和转化有关的功能基因增加。探究结果还表明，没有饲喂药物的猪内也具有较高的抗生素抗性基因，但饲喂药物的猪体内抗生素抗性基因的丰富性和多样性都增加。一些丰富的基因如氨基糖苷类的 O磷酸基转移酶对试验中没有使用的抗生素也产生抗性。这表明，其对没有被饲喂的抗生素有间接选择的潜力。抗生素亚治疗剂量饲喂的副作用是明显的，并且必须考虑对成本效益分析。关键词：肠道菌群，微生物组转化，猪肠

3、道内细菌，Bio Trove 芯片，基因组分析。在传统的农业饲养技术中，抗生素是维持或改善动物健康和饲料转化率的最具成本效益的一种方式。除了提高饲料的转化率外，抗生素也普遍用于牲畜、家禽以及鱼类的疾病治疗和预防。据报道，农业使用的抗生素总量占据美国各类抗生素生产总量的一半。尽管抗生素的使用对农业的作用非常明显，但是抗生素的滥用以及动物和人类病原菌对多种抗生素的抵抗性的迅速、普遍的出现，已经使人类对当前抗生素的使用产生质疑。对环境和肠道微生物群落的研究揭示了抗生素抗性基因的丰富多样性。添加抗生素进行饲喂，提供了一种选择压力，这可能导致牲畜体内共生的生物群落产生持续的变化。此外，抗生素抗性基因的存

4、在已被证明在细菌群落中是稳定的，即使在没有抗生素的情况下也存在。对抗生素抗性基因丰富性增加的主要担心是抗性基因向病原体中的转化。因此，食品和药物管理局最近发布了一份草案，建议限制抗生素在畜牧业的使用。而美国社会传染病监测机构早在国会委员会通过之前就支持这种限制。动物肠道内定居的细菌对维持宿主的健康有重要作用。肠道微生物有助于宿主对营养物质的吸收，增强宿主免疫系统并促进肠道上皮细胞的形成，是一个抵抗病原体的天然防御系统。然而和这些好处相反，肠道菌群有可能通过远缘生物进行抗性基因的扩散，对将来的治疗产生抗性。例如，人类结肠癌细胞中的共生细菌藏有抗生素抗性基因，且能够将这些基因转移给病原体。事实上，

5、水平基因转移在很大程度上是由革兰氏阴性菌的多重耐药性引起的。随着对人类食物链中所含共生菌中的抗生素抗性基因的确定，作为动物和食源性致病菌的抗性基因储存者的肠道微生物，其作用需要进一步探索研究。通过培养和 PCR 方法对狭窄组的细菌或基因组进行研究，已经获得了一些有价值的见解，如猪体内分离的红霉素抗性基因；然而，每日饲喂压剂量的抗生素对牲畜体内的微生物的综合作用还没有研究。因此，我们试图对饲喂抗生素对整个肠道内微生物群系的影响进行一个广泛性的评估。 采用种群类型分析、宏基因组学和平行定量 PCR 追踪微生物菌株间和编码功能的变化，有利于对所谓的抗生素的副作用效果的检测（也就是促进生长和预防疾病之

6、外的其他效果） 。这些负效应包括大肠杆菌的数量增加和抗生素抗性基因丰度的增加。仔猪在艾姆斯IA 国家动物防疫中心出生，并在高度控制和净化的室内饲养，避免加药动物、非加药动物和栏里面的其他动物发生药物之间的交叉污染。无论仔猪还是母猪实验之前都没有接触抗生素。这种设计是为了确保从母体获得同水平的仔猪，最大限度的减少变异，使抗生素治疗的效果能够被检测。在18 周龄时，同窝猪仔的一组饲喂 ASP250 饲料（含有药物） ，另一组饲喂未修饰的饲料（不含药物） ，饲喂 3 周。ASP250 是一种抗生素类的饲料添加剂，含有金霉素、磺胺、青霉素，通常用于猪细菌性肠炎的治疗和提高饲料转化效率。采集处理前 0

7、天和处理后 3，14 和 21 天的粪便样本。0 天样本用来描述抗生素治疗以前的猪肠道内微生物群系。结论：饲喂 ASP250 的微生物区系成员的转变。从 12 份粪便样品中，分离 16S rRNA 基因中 V3 区的 133，294 序列。对相同处理和取样日期相同的猪的数据进行分组，评价抗生素对群系微生物成员的作用效果。据哺乳动物肠道环境的报道和最新的宏基因组学研究，大部分可分类的序列，属于拟杆菌、厚壁菌以及变形菌群（如表 S1） 。拟杆菌中的普雷沃菌属一贯丰富，作为猪体内微生物组特征的展现。用布雷斯柯蒂斯指数对所有样品进行组合计算和相似性分析。对这些数据进行非度量多维尺度（NMDS）的绘图表

8、明饲喂 14 天的样本与 0 天的样本 (P0.05） 。误差线代表SEM。(C) 依据对耐药性基因丰度的qPCR的数据计算Bray-Curtis 相似性系数 并绘制多维尺度图。点与点之间的距离，表明样品间抗性基因的多样性的差异程度。样本离群值（方形）来自于第21天药物处理猪。0天样品的测量不显示。Table 1. 处理期间，用宏基因组每个耐药基因在宏基因组中的序列号：药物处理（n=1） VS 非药物处理（ n=3） 和qPCR基因拷贝数/16S rRNA的基因拷贝数检测药物处理和非药物处理的猪的粪便样本中耐药性基因的差异描述(P 0.05)。 通过qPCR检测ASP250处理增加了抗性基因类

9、型的多样性 香浓指数1.4（药物处理） ，0.8（无药物处理)，P=0.04。采用t检测法对14天药物处理样品的宏基因组与相应的无药物处理的宏基因组中抗性基因的平均数量的比较证实了这一结论（P0.05） 。此外，抗性基因区的结构被抗生素改变，可由Bray-Curtis的双向ANOSIM（P0.01 ）确定。然而，对照 R值是0.25，表明分离程度是有限的。不过，用ASP250 处理抗性基因的多样性比较集中，可能是因为抗生素的选择压力（如图2C ） 。综合起来看，这些结果表明喂养抗生素可增加个体样品中抗性基因的得多样性以及均质化，均质化即为不同处理样品间的多样性。讨论采用种群型、宏基因组学和qP

10、CR方法评估了ASP250对猪体内抗生素抗性基因的作用。结果表明猪体内的肠系微生物具有潜在的抗性基因，即使在没有选择压力的条件下也是如此。特别是有五个基因，在饲喂药物和无药物饲喂的样品的微生物群系中都能高频率检测。这些基因可能代表了这批猪的核心抗生素抗性基因组。事实上，这表明tet在农场动物中含量丰富，我们的数据支持了的结论。饲喂抗生素产生持续的选择压力50y已经在猪肠道菌群里建立了一个抗性的高背景水平。即使在抗性较高的背景下抗生素的处理也能增加抗性基因的丰度，其中许多可能是因为与ASP250中的抗生素直接作用而变得丰富。例如，磺胺二甲嘧啶可能是磺胺抗性基因 sul2 or sul1，饲喂药物

11、的动物样品中九个中有八个都能检测到。此外，在饲喂药物的动物中A 类-内酰胺酶过度表达并使其获得抗性，可以裂解-内酰胺抗生素如青霉素。许多其他丰富性抗性基因的功能是通过向外输出化学物质。这些外流物质包括但不限于抗生素，也可能是缺少具体的抗性基因但能在抗生素压力下生存的细菌。多药物的外排往往伴随着令人担忧的多耐药性医疗问题以及可转移基因因素的出现。除了对特定的基因家族的影响，饲喂抗生素的同类中，个体的抗性基因的丰富性随着时间的推移增加。尽管整个样品中有大量的抗性基因异质性，但当前的研究深度可以使这些有趣的现象可视化。尽管他们没有赋予其中抗生素的抗性，但使用ASP250喂养，氨基糖苷类O-磷酸转移酶

12、类型的抗性大量增加。在药物喂养的猪宏基因组中，13个已被鉴定的磷酸转移酶中的10个和大肠杆菌O86:H- (accession number YP_788126).的pO861质粒上链霉素磷酸转移酶基因同源（ 70%的氨基酸完全一致） 。在选择压力（30）下，抗性基因在质粒上集中分布，pO86A1至少携带两个其他的抗性基因（编号为NC_008460） 。在可动遗传因子 上这些抗性基因的聚集体能够为细菌生存提供最适应的有利条件，在持续有抗生素存在的情况下。然而，这是喂养抗生素的一个不需要的副作用，因为这些抗性基因簇在猪肠道内或农业环境中能够转移给大肠杆菌或其他人类的病原菌中。选择机制和结果表明抗

13、生素的使用增加了针对性抗性基因的丰度，超越了对来自于猪肠道菌群不同背景的抗生素抗性基因的抗生素的管理，这增加了可检测性，即使在抗性基因多样性的高背景下。抗生素的副作用超出了抗性基因的影响。COGs对猪肠道菌群的统计分析表明，基因编码的毒性、基因转移以及能量的产生和转化功能通过饲喂抗生素选择。具体的过度表达COGs包括一些与P菌毛装配有关的基因，P菌毛为大肠杆菌的附属物和毒性物质。另外，COGs在药物处理的额宏基因组的作用还包括易位酶，参与抗性基因的转移。这些功能可以提高耐药基因在微生物群落中的稳定性和传播。此外，编码能量产物和功能转化基因的丰度的增加可能是因为一些抗生素的促生长特性，需要进一步

14、实验对其检测。在农业动物饲养中，认为抗生素的主要作用是通过减少菌量提高饲料转化率，通过减少对营养的竞争对宿主有利，减少宿主对微生物响应的成本。抗生素处理后，对猪的代谢进行分析表明，饲喂抗生素对多种合成途径有作用，包括糖、脂肪酸、胆汁酸、类固醇激素的合成。因此，COGs可能是一个有用的标识，用于识别微生物及其功能对抗生素如ASP250促生长作用的重要性。微生物功能的变化导致微生物菌群成员的变化令人关注的是成员关系的转化已经被检测。在处理的动物体内，拟杆菌门的减少可能是由于使用ASP250作为饮食饲喂猪促进生长的好处。与瘦的小鼠相比，胖鼠粪便内的拟杆菌相对于厚壁菌来说含量较低。可能是因为这种改变，

15、胖鼠体内的能量吸收能力提高，也许这种转变也与猪体内饲料的转化改善有关。此外，在哺乳动物的肠道菌群中，口服抗生素治疗普遍引起了大肠杆菌的增加，已经报道的有阿莫西林，甲硝唑和铋，甲硝唑，万古霉素，亚胺培南。然而，阿莫西林加上-内酰胺类抑制剂克拉维酸通过饲喂和注射都会导致猪体内大肠杆菌数量的减少，在人类治疗期内口服环丙沙星可造成变形杆菌种群数量下降。这些结果对不同抗生素产生不同的副作用来说是一个重要的提示。大肠杆菌是哺乳动物胃肠道内共生的且是治病的细菌，无论对宿主还是在食物链中，数量的增加可能是有益的也可能是有害的。此外，大肠杆菌数量的增加与孕妇体重的过度增加有关，这是对宿主产生的不利的作用结果，但

16、是同样在牲畜体内这类菌是一个潜在的促生长作用。因此，一个理想的结果必须仔细的权衡使用抗生素的成本和效益。微生物群落间罕见的成员之间在处理和控制之间的差异缺少理解，有待进一步的调查研究。这些细菌在处理作用下增加，栖热球菌门的成员是已知的耐环境压力菌；这些生物体最近在人的肠到内分离出来。此外，瘤胃球菌属在反刍动物中普遍存在，且在猪的后肠中也经常被发现。这类菌善于降解纤维素，用抗生素处理后瘤胃球菌属的数量增加，可能有利于饲料在猪体内的转化。总的来说，数据提供了多种可能性，为如何通过定量的饲喂抗生素调节猪肠道微生物菌群，使饲料的利用效率得到改善和提高。结论结果表明，即使是低剂量短期的饲喂抗生素，也能增

17、加耐药性基因的丰富性和多样性，其中包括对没有给予添加的抗生素的耐性，并增加了大肠杆菌的数量，这是一个潜在的人类病原菌。此外，宏基因组分析表明附带功能可能涉及饲料转化率的提高。本研究的设计特色是对环境的控制，采用统一的接种源（母体） ，宿主遗传的控制，在实验之前母猪或仔猪都不接触抗生素处理，除了一组含有ASP250对所有的猪采用相同的饮食。未来的研究内容应包括饲喂其他抗生素，具有较高繁殖能力的猪产的同窝猪仔，并确定导致饲料利用效率提高的抗生素诱导机制。在讨论农业管理政策和评估传统抗生素替代品时，需要考虑耐药性对人和动物健康的影响。随着畜牧业的发展，抗生素的使用发展到一个十字路口，需要进行像本实验

18、的研究和其他对抗生素附带作用阐明的研究。材料与方法整个方案依据SI Materials and Methods。猪：研究中用的六头猪选自同窝猪仔，每组三头，分成两组：一组接受抗生素处理，一组没有抗生素处理。按照国家动物疾病中心动物护理和使用委员会的准则饲养。研究之前对猪圈进行净化消毒处理。怀孕母猪从养猪场获得，在实验之前没有接触过抗生素。出生3周后的猪仔与母猪共养在同一栏中，仔猪的粪便作为重要的细菌接种物。断奶后，所有的猪仔研究开始之前饲喂相同的饮食（ 17-25 TechStart肯特饲料） ，研究开始时，将 药物饲喂的猪被转移到一个新的洁净室，按上述的饮食饲喂但包含有ASP250（金霉素1

19、00克/ 吨，磺胺100克/吨，青霉素50克/吨） 。采集无药物处理和有药物处理动物的新鲜粪便，选择处理前（无药物和有药物处理0天）和处理后3,24,21天的时间采样。DNA测序：粪便中的DNA采用磁珠搅拌分离，并对16S rRNA基因的V3区进行扩增和测序。PCR产物在454基因组测序仪FLX 上进行测序，使用制造商提供的FLX化学方案（罗氏诊断法） 。从粪便中分离的 DNA按处理组（有药和无药）和取样时间点（0天，14天）进行汇集。第14天的样品用FLX化学试剂进行测序，0天的用钛化学试剂进行测序（罗氏诊断法） 。种型分析：只有大于50bp的序列用来进行种型分析，12个样本中这类序列总数达

20、133,192个序列 (70,667 为一个序列) 。按编码把样品分级后，利用核糖体数据库项目的eb 工具依据 16S rRNA基因的V3区进行系统发育分析和分类。此外，用mothur软件包进行种型比较和假设检验。由个体动物在0天和14天取样中获得的16SrRNA数据推算出Bray-Curtis相似性系数，并绘制 NMDS图，展现样品之间的相似性。使用PAST进行MDS 绘图和相似性统计检验分析。宏基因组分析：通过BLAST对序列依据非冗余数据库和ARDB进行去折叠并分析。BLAST报告对提取的COGs进行解析，利用ShotgunFunctionalize R对COGs进行频率分析。ARBD由

21、刘和Pop 好心提供，以至于我们能在此进行BLAST分析。在这两种分析中，P0.05是显著差异，显著的COGs 用其各自的COG类别标记处可视的变化趋势。生态分析，采样数量按规范化为100,000递交读数，用NMDS 分析，并在PAST 中用 Bray-Curtis 相似性测量进行群集分析。定量PCR: 引物链含有 18种抗性类型，符合ARDB 的BLAST工具设计的所有引物要求（如表S4 ） ，当采用 ARDB BLAST没有获得结果时，也可采用国家生物信息中心的BLAST工具（S5） 。定量PCR 引物，试剂和DNA 样品装入有六个子数组的开放数组板（Applied Biosystems公

22、司） 。每33nlqPCR反应，加入1ng 的提取DNA作为模板。定量PCR所需的试剂和条件按先前描述的配置。相关基因的拷贝数按下列公式计算：基因拷贝数=10 (26Ct)/(10/3), 其中Ct相当于循环阈值（如表56） 。放大曲线采用质量控制措施进行手动检查。16S rRNA基因的丰度被测定，大肠杆菌采用 uidA引物群进行量化。uidA和16S rRNA基因的拷贝数由相关的标准曲线计算出来，标准曲线用10 8溶液按10倍梯度稀释100份作为母样进行绘制，一式三份。针对这些反应的16S rRNA和uidA基因分别从开放数组板中制作。qPCR结果统计分析：丰富性和多样性。所有的qPCR数据

23、在样品之间进行规范化，按照16S rRNA基因的拷贝数来区分，随后自然转化实现正常分布。重复测量方差分析模型用于确定处理时间是否与抗生素抗性基因的丰富性显著相关和不同样品中的香浓多样性。最好为每个相应变量进行残差的协方差结构测定和重复的测量方差分析测试（SAS v9.2; SAS Institute） 。在抗性基因或抗性基因型的比较中没有进行邦弗朗尼调整，因为测试电源的过度减少，因此报告的P 值没有进行多重比较的校正。使用样本之间正常化的数据通过PAST ver. 1.87 计算出香浓系数的多样性（抗性基因拷贝数/16S rRNA基因拷贝数） 。使用自然对数转换的数据对每个样本使用自然对数转换

24、的数据进行Bray-Curtis系数推算。利用这些数据进行双向多变量分析，把处理和时间作为两个因素考虑。使用Bray-Curtis测得的多样性来完成双向多变量分析和NMDS分析。致谢！作者非常感谢 Sam Humphrey, Uri Levine, 和Lea Ann Hobbs的技术支持；Vince Young的一些有益的交流；密歇根州立大学的作物和土壤科学统计咨询中心的建议。和Rich Zuerner和汤姆凯西对手稿上的指导。美国密歇根州立大学的研究发起下抗生素耐药性的贮藏以及由美国密歇根州立大学的制药环境研究机构提供的支持。参考文献：1. Cromwell GL (2002) Why an

25、d how antibiotics are used in swine production. AnimBiotechnol 13:727.2. Dibner JJ, Richards JD (2005) Antibiotic growth promoters in agriculture: History and mode of action. Poult Sci 84:634643.3. Lipsitch M, Singer RS, Levin BR (2002) Antibiotics in agriculture: When is it time to close the barn d

26、oor? Proc Natl Acad Sci USA 99:57525754.4. Levy SB (1978) Emergence of antibiotic-resistant bacteria in the intestinal flora offarm inhabitants. J Infect Dis 137:689690.5. Aarestrup FM, Wegener HC (1999) The effects of antibiotic usage in food animals on the development of antimicrobial resistance o

27、f importance for humans in Campylobacter and Escherichia coli. Microbes Infect 1:639644.6. Allen HK, et al. (2010) Call of the wild: Antibiotic resistance genes in natural environments. Nat Rev Microbiol 8:251259.7. Sommer MO, Dantas G, Church GM (2009) Functional characterization of the antibiotic

28、resistance reservoir in the human microflora. Science 325:11281131.8. Martinez JL, et al. (2009) A global view of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev 33:4465.9. Gtz A, et al. (1996) Detection and characterization of broad-host-range plasmids in environmental bacteria by PCR. Appl Environ Micro

29、biol 62:26212628.10. Salyers AA, Ambile-Cuevas CF (1997) Why are antibiotic resistance genes so resistant to elimination? Antimicrob Agents Chemother 41:23212325.11. Stanton TB, Humphrey SB (2011) Persistence of antibiotic resistance: Evaluation of a probiotic approach using antibiotic-sensitive Meg

30、asphaera elsdenii strains to prevent colonization of swine by antibiotic-resistant strains. Appl EnvironMicrobiol 77:71587166.12. Stanton TB, Humphrey SB, Stoffregen WC (2011) Chlortetracycline-resistant intestinal bacteria in organically raised and feral Swine. Appl Environ Microbiol 77:71677170.13

31、. Martnez JL (2008) Antibiotics and antibiotic resistance genes in natural environments.Science 321:365367.14. US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, and Center for Veterinary Medicine (2010) Draft guidance #209. Available at http:/www.fda.gov/downloads/animalveter

32、inary/guidancecomplianceenforcement/ guidanceforindustry/ucm216936.pdf. Accessed October 12, 2010.15. The Infectious Diseases Society of America (2010) Antibiotic resistance: Promoting judicious use of medically important antibiotics in animal agriculture. Presentation before the House Committee on

33、Energy and Commerce Subcommittee on Health.www.idsociety.org/WorkArea/DownloadAsset.aspx?id=16796.16. Zoetendal EG, Cheng B, Koike S, Mackie RI (2004) Molecular microbial ecology of the gastrointestinal tract: From phylogeny to function. Curr Issues Intest Microbiol 5:3147.17. Karami N, et al. (2007

34、) Transfer of an ampicillin resistance gene between two Escherichia coli strains in the bowel microbiota of an infant treated with antibiotics. JAntimicrob Chemother 60:11421145.18. Shoemaker NB, Vlamakis H, Hayes K, Salyers AA (2001) Evidence for extensive resistance gene transfer among Bacteroides

35、 spp. and among Bacteroides and other genera in the human colon. Appl Environ Microbiol 67:561568.19. Leverstein-van Hall MA, et al. (2002) Evidence of extensive interspecies transfer of integron-mediated antimicrobial resistance genes among multidrug-resistant Enterobacteriaceae in a clinical setti

36、ng. J Infect Dis 186:4956.20. Barbosa TM, Scott KP, Flint HJ (1999) Evidence for recent intergeneric transfer of a new tetracycline resistance gene, tet(W), isolated from Butyrivibrio fibrisolvens, and the occurrence of tet(O) in ruminal bacteria. Environ Microbiol 1:5364.21. Stanton TB, Humphrey SB

37、 (2003) Isolation of tetracycline-resistant Megasphaera elsdenii strains with novel mosaic gene combinations of tet(O) and tet(W) from swine. Appl Environ Microbiol 69:38743882.22. Li X, Wang HH (2010) Tetracycline resistance associated with commensal bacteria from representative ready-to-consume de

38、li and restaurant foods. J Food Prot 73:18411848.23. Wang Y, Wang GR, Shoemaker NB, Whitehead TR, Salyers AA (2005) Distribution of the ermG gene among bacterial isolates from porcine intestinal contents. Appl Environ Microbiol 71:49304934.24. Ley RE, Lozupone CA, Hamady M, Knight R, Gordon JI (2008) Worlds within worlds: Evolution of the vertebrate gut microbiota. Nat Rev Microbiol 6:776788.