1、鸡新城疫诊断技术规程1 范围本规程引用 GB16550-1996 新城疫检疫技术规范。本规程规定了新城疫群体检疫、个体检疫、实验室检验和检疫后处理的技术规范。本规程适用于鸡和其他可感染新城疫的禽类。2 群体检疫对养禽场、独立饲养的禽群及外售、外运的禽群施行检疫。2.1 查明疫病背景通过询问兽医人员或检查疫病记录，检查被检禽场（群、室）在过去的一年内是否有出现过新城疫临诊病例，是否有与新城疫接触史，周围 2km 范围内是否发生过新城疫。2.2 查清免疫状况通过查验免疫证明或查询其他资料，检查被检群是否已按规定注射合格疫苗。如按规定免疫并正处于规定的保护期内，禽只健康状况良好，被认为免疫合格。如免
2、疫不符合规定要求，要以合格疫苗再次接种，隔离饲养观察至群体抗体滴度达 25 以上，全群健康，认为免疫合格；观察期内发现疑似新城疫病禽，须按 2.3 和 2.4 条要求进一步检查。2.3 群体临诊检查首先作静态检查，让禽群处于静止状态，观察营养状况、精神状态、呼吸、粪便、鼻和口腔分泌物有否异常。然后观察禽只运动状况，有否跛行、共济失调、痉挛等异常现象。检查中重点注意以下情况：a.精神沉郁或无任何症状而死亡； b.体温升高、食欲减退、精神委顿、产蛋减少或停止；c.口腔和鼻腔分泌物增多，素囊胀满；d.呼吸困难、喉部发出“咯咯“声（晚间较明显） ；e.下痢，粪便成绿色；f.偏头转颈，作转圈运动或共济失
3、调。若发现疑似病例，按 2.4 条要求进一步检查，同时对全群隔离饲养。2.4 病理解剖检查对临诊疑似病例，应全部或抽样解剖，依据下述病变作出初步判断：a.口腔、喉部有粘液，咽部粘膜出血；b.腺胃乳头肿胀，挤压后有豆腐渣样坏死物流出，乳头有散在的出血点；c.肌胃角质下层有条纹或点状出血、有时见不规则溃疡，腺胃与肌胃交接处有出血斑、条；D 小肠前段有大面积散在出血点，或肠粘膜有纤维性坏死并形成假膜，假膜下出现红色粗糙溃疡；E 盲肠和直肠皱褶处有出血 ，盲肠扁桃体（淋巴滤泡）出血坏死；F 气管粘膜充血、出血、气管内有粘液；G 心冠脂肪、心外膜及心尖脂肪上有针尖状小出血点。3 个体检疫3.1 在无群体
4、检疫条件的场合，须进行个体检疫。个体检疫合格的禽只一般供食用，如继续饲养应隔离 3 周，经观察无异常后，方准与其它禽只混养。3.1.1 查明是否来自疫区。3.1.2 查验免疫证明。3.1.3 临诊检查和病理解剖检查检查内容参照 2.3 条和 2.4 条进行，发现疑似新城疫染疫禽只，立即作无害化处理。4 实验室检验4.1 下列情况进行实验室检查a. 产地定期检疫；b. 监测免疫状态；c. 疑似病鸡的定性，或临诊及解剖检查初步诊断为新城疫，需进一步确诊；d. 检疫中发现重大疫情（如禽流感） ，须作鉴别诊断；e. 行政主管部门、饲养单位、售购或争议双方要求进行实验室诊断。4.2 实验室检测方法a.
5、病毒分离鉴定试验，见附录 A。b. 血凝抑制试验，用于免疫监测，见附录 B。5. 检疫后的处理5.1 经临床检查、解剖检查和实验室诊断等综合判断，确诊为新城疫的禽群或禽只，按GB16548 处理。5.2 经初步诊断为新城疫可疑的禽群（禽只） ，按下述方法之一处理：a. 除将可疑禽只按 5.1 条处理外，全群隔离饲养，并进行紧急免疫接种，如在接种后观察期内出现可疑禽只，亦按 5.1 条处理，观察 21 天后，对临床健康，免疫滴度达到 25 以上的禽只，经体表消毒后按健康禽只对待。b. 经初步诊断为新城疫可疑的禽群（禽只） ，在全部隔离饲养的同时，对可疑禽只采样作实验室诊断，如确为新城疫者，全群即
6、按 5.1 条处理。5.3 发生过新城疫的禽场在半年之内，其禽只不准出售、外运。附录 A 病毒分离鉴定试验A1 仪器设备注射器：1ml。注射针头：55.5 号。血凝试验板：V 型、96 孔。微量移液器：50ul。恒温箱。超净工作台或无菌室。A2 试剂。无菌生理盐水。青霉素。链霉素。标准阳性血清。A3 样品采集及处理A3.1 活禽用气管拭子和泄殖腔拭子（或粪） 。A3.2 死禽以脑为主；也可采心、肝、脾、肾、气囊等组织。A3.3 样品用生理盐水研成 1： 5 乳液；拭子侵入 23ml 生理盐水中，反复吸挤压至无水滴出，弃之。溶液中加入青霉素（使终浓度为 1000 单位/ ml ） 、链霉素（使终
7、浓度为 1mg/ml ） 。泄殖腔拭子（或粪）样品，青霉素、链霉素量提高 5 倍。然后调 pH 7.07.4，37作用 1h ，再 1000r/分钟离心 10 分钟，取上清 0.1ml，经尿囊腔接种 910 日龄 SPF 鸡胚。A4 培养物的收集及检测A4.1 培养 47 天的尿囊液经无菌采集后 -20保存.A4.2 尿囊液按附录 B 作血凝试验，并与标准阳性血清作血凝抑制试验，确定有无 新城疫病毒繁殖。A4.3MDT（最小病毒致死量引起鸡胚死亡的平均时间）的 测定：将新鲜尿囊液用生理盐水连续 10 倍稀释，10 -610-9 的 每个稀释度接种 5 个 910 日龄 SPF 鸡胚，每胚0.1
8、ml，37孵化。余下的病毒保存于 4，8h 后 以同样方法接种第二批鸡胚，连续 7 天内观察鸡胚死亡时间并记录，测定出最小致死量，即引起被接种鸡胚死亡的最大稀释倍数。计算 MDT。A4.4 以 MDT 确定病毒的致病力强弱，4070h 死亡为强毒， 140h 以上为弱毒。附录 B 鸡新城疫微量红细胞凝集抑制试验B1 仪器设备B1.1 微量血凝板：V 型、96 孔。B1.2 微型振荡器。B1.3 塑料采血管。B1.4 移液器：50ul. B2 试剂B2.1 稀释液pH7.07.2 磷酸缓冲盐水氯化钠（GB126677） 170g磷酸二氢钾（GB127477） 13.6g氢氧化钠（GB62977）
9、 3.0g蒸馏水 1000ml高压灭菌，4 保存，使用是作 20 倍稀释。B2.2 浓缩抗原B2.3 0.5%红细胞悬液采成年鸡血，用 20 倍量磷酸缓冲盐水洗涤 34 次，每次以 2000r/min 离心 34 分钟，最后一次 5 分钟，用磷酸缓冲盐水配成 0.5%悬液。B2.4 标准阳性血清B3 被检血清每群鸡随机采 2030 份血样，分离血清。采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至 68cm 长。将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以 1000r/min 离心 5 分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于
10、 0oC 保存。B4 操作方法B4.1 微量血凝试验B4.1.1 于微量血凝板（B1.1）的每孔中滴加稀释液（B2.1）50ul，共滴四排。B4.1.2 吸取 1:5 稀释抗原滴加于第一列孔，每孔 50ul，然后由左至右顺序倍比稀释至第 11列孔，再从第 11 孔各吸取 50ul 弃之。最后一列不加抗原作对照。B4.1.3 于每孔加入 0.5%红细胞悬液（B2.3）50ul 。B4.1.4 置微型振荡器（B1.2）上振荡 1 分钟，或手持血凝板绕圆圈混匀。B4.1.5 放室温下（1820 oC）3040 分钟，根据血凝图象判定结果。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排重复
11、，以几何平均值表示结果。B4.1.6 计算出含 4 个血凝单位的抗原浓度，按式（ B1）进行计算。抗原应稀释倍数=血凝滴度/4(B1)B4.2 微量血凝抑制试验B4.2.1 先取稀释液（B2.1）50ul，加入微量血凝板（B1.1）的第一孔，再取浓度为 4 个血凝单位的抗原依次加入 312 孔，每孔 50ul，第二孔加浓度为 8 个血凝单位的抗原 50ul。B4.2.2 吸被检血清(B3)50ul 于第 1 孔(血清对照) 中,挤压混匀后吸 50ul 于第 2 孔,依次倍比稀释至 12 孔,最后弃去 50 ul.B4.2.3 置室温(1820)下作用 20 分钟.B4.2.4 滴加 50ul
12、0.5%红细胞悬液 (B2.3)于各孔中,振荡混合后,室温下静置 3040 分钟,判定结果B4.2.5 每次测定应设已知滴度的 标准阳性血清(B2.4)对照.B5 结果判定B5.1 在对照出现正确结果的情况下,以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度.B5.2 若有 10%以上的鸡出现 11(log2)以上的高血凝抑制滴度,说明鸡群已受新城疫强毒感染.B5.3 若监测鸡群的免疫水平, 则血凝抑制滴度在 4(log2 )的鸡群保护率为 50%左右; 在 4(log2)以下的保护率达 90%-100%;在 4(log2)以下的 非免疫鸡群保护率约为 9%,免疫过的鸡群约为 43%.鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示,如平均水平在4(log2 )以上,表示该鸡群为免疫鸡群.
