1、实操四 甲基红(MR)试验和乙酰甲基甲醇试验(VP 试验)一、甲基红(MR)试验1实验目的(1)了解甲基红试验的反应原理和用途。(2)学习甲基红试验的操作技术。2原理多数细菌能分解葡萄糖，但分解葡萄糖的途径和产物不完全相同。例如大肠杆菌和产气肠杆菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，若继续代谢还能生成其它有机酸和醛、醇等化合物。其中，大肠杆菌所产生的酸能使培养液的 pH 降到 4.2 或更低，可使甲基红指示剂变成红色，并至少持续 4d 之久。因此，甲基红试验是测定细菌利用葡萄糖产酸能力的强弱。但这些微生物可将产生的酸进一步代谢，在 4d 或更长时间内生成中性化合物，不具有使甲基红变红的能力。因此进行这项试
2、验时，观察时间显得很重要。肠道杆菌生长在 37以下 4d 观察为宜，其它细菌也可参照同样时间。3实验材料(1)菌种 大肠杆菌(Escherichia coli)和产气杆菌（Enterobacter aerogenes)。(2)培养基 缓冲葡萄糖蛋白胨水(附录一 9)。(3)其它 酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等。(4)试剂 甲基红试剂(附录一 46)。4方法与步骤取缓冲葡萄糖蛋白胨水培养基试管三支，于其上分别做好培养基名称和试验菌种、空白样等标记，然后无菌操作将实验菌种接入相应的试管中，连同空白对照置 361恒温箱中培养 24d 后进行观察和记录结果。5结果与讨论在试验试管及空白管中各加入甲
3、基红试剂 56 滴，呈鲜红色者为甲基红试剂阳性，呈橘红色者为弱阳性，呈橘黄色者为阴性。二、乙酰甲基甲醇试验(VP 试验) 1实验目的(1)了解 VP 试验的反应原理及用途。(2)学习 VP 试验的操作技术。2原理和 MR 试验一样，VP 试验也是检验微生物利用葡萄糖产酸的能力。产气肠杆菌利用葡萄糖产生丙酮酸后，可进一步使一部分丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在强碱环境中，能被空气中的氧气氧化，生成双乙酰，双乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用生成红色化合物。此即为 VP 试验阳性。当在试管中加入萘酚时，可如果某细菌在 4d 期间 MR 和 vP 反应均为阳性，可延长培养时间，以确定生
4、成的酸是否能转化成乙酰甲基甲醇。对于一些发酵迟缓的微生物可能实验结果均为阴性，也应延长培养时间，以判断微生物是否能利用葡萄糖产生大量酸。对于一种微生物，MR 试验阳性，V-P反应一定阴性，反之亦然。3实验材料(1)菌种大肠杆菌(Escherichia coli)和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)。(2)培养基缓冲葡萄糖蛋白胨水培养基(附录9)。(3)其它酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等。(4)试剂 6萘酚酒精溶液，40氢氧化钾溶液。4方法与步骤 同 MR 试验。5结果与讨论在上述三支试管中分别按培养液一半的量加入 6萘酚酒精液，摇匀，再按培养液13 的量加入 40%氢
5、氧化钾溶液，充分摇匀，观察结果，呈现红色者为 VP 试验阳性，记做“+”号；不呈现红色者，为阴性，记做“一”号。但后者应放在 361下培养 4h再进行观察判定。实操五 吲哚试验和石蕊牛奶试验一、产生吲哚试验1实验目的(1)了解吲哚试验的反应原理和用途。(2)学习吲哚试验的操作技术。2原理某些细菌具有色氨酸水解酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但加入对二甲基氨基苯甲醛试剂，使之与吲哚作用，可生成红色的玫瑰吲哚。其反应如下：3实验材料(1)菌种大肠杆菌，(Escherichiali)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes).(2)培养
6、基蛋白胨水培养基(见附录lO)。(3)其它酒精棉球，酒精灯，接种环，洗耳球，lmL 吸管及恒温箱等。(4)试剂 吲哚试剂 有两种：柯凡克氏试剂(附录一 47)、欧一波试剂(附录 III 一 48)。4方法与步骤 将测试菌接种于蛋白胨水培养基中，37培养 l2d，必要时可培养 45d，观察结果。5、结果与讨论 取培养好的试管，加入约 0.5mL 乙醚，振摇均匀后，静置分层，再沿管壁加入约1.5mL 的吲哚试剂。阳性者，在上层的乙醚层呈玫瑰红色，否则为阴性。二、石蕊牛奶试验1实验目的(1)了解石蕊牛奶试验的反应原理及用途。(2)学习石蕊试验的操作技术。2原理牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白。在牛奶中加入
7、石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色。还原时，则随还原程度的大小，部分或全部脱色。细菌对牛奶的作用有以下几种情况：产酸：细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。产碱：细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。胨化：细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶变得比较澄清。酸凝固：细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红，当酸度很高时，可使牛奶凝固。凝乳酶凝固：有些细菌能产生凝乳酶使牛奶中的酪蛋白凝固，此时石蕊呈蓝色或不变色。还原：细菌生长旺盛时。使培养基氧化还原电位降低，因而石蕊褪色。3实验材料(1)菌种大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌（Salmonel
8、la sp.)。(2)培养基石蕊牛奶培养基试管(附录一 11)。(3)其它酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等。4方法与步骤按从固体斜面到液体培养基中的接种方式接种待测菌株，空白对照和待测菌株试管于 37恒温培养 23d 后观察结果，但切记观察时不要摇动试管。5结果与讨论试验结果以表格方式报告。观察时，应注意以下情况：(1)牛奶的 pH 为 6.7 左右，石蕊在牛奶中由于牛奶的影响不呈蓝色而近于紫色，且随时间的延长而下沉，使用前要摇匀。(2)接菌培养产酸时，一般不呈红色，是因石蕊被还原。牛奶培养基的浅紫色消退，培养时间长了，石蕊接触空气又被氧化，表面出现浅红色。(3)该试验连续观察很重要，因为产
9、酸、凝固、胨化各现象是连续出现的，往往是在清楚地看到某种现象时，另一现象已经消失。实操六 -半乳糖苷酶试验和酪蛋白分解试验一、-半乳糖苷酶试验1、实验目的(1)了解 -半乳糖苷酶试验的用途与原理。(2)学习 -半乳糖苷酶试验的操作技术。2、原理在邻硝基酚 -D- 半乳糖苷培养基（ ONPG 培养基）中含有邻硝基酚 -D-半乳糖苷和PH7.5 的 0.01molL 的磷酸缓冲液。当试验菌产生 - 半乳糖苷酶时，邻硝基酚 -D- 半乳糖苷被水解，释放出邻硝基酚，此物为酸碱指示剂，它的指示范围是 6.8(无色) 一 8.6(黄色)，故能使 pH7.5 的培养液成为黄色，否则不变色。3、实验材料 (1
10、)菌种: 大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草杆菌。(2)培养基 ONPG 培养基(附录一 4)。(3)其它酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱等。4、方法与步骤取 ONPG 培养基试管三支，于其上分别做好培养基名称和“大肠杆菌” 、 “爱德华氏菌”、 “空白对照”等标记，然后分别将试验菌相应地接入 ONPG 培养基中，连同对照，置361培养 13h 和 24h，观察结果。5、实验结果试管中培养基颜色变黄者为该试验阳性，记“+”号，否则记“一”号。二、酪蛋白分解试验一、实验目的(1)了解酪蛋白分解试验的用途及原理。(2)学习酪蛋白分解试验的操作技术。二、原理某些菌具有酪蛋白分解酶，而
11、有的菌则不具有。具有酪蛋白分解酶的细菌在酪蛋白琼脂平板上可以分解酪蛋白而使菌落周围形成透明圈。三、实验材料(1)菌种蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus ） 。(2)培养基酪蛋白琼脂培养基平板( 附录一 19)。(3)其它酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等。四、方法与步骤以划线接种法将试验菌接种于酪蛋白琼脂培养基上，然后置 37恒温箱培养 12d 后，五、实验结果平板中菌落周围有透明圈者，为酪蛋白分解试验阳性。反之为阴性。实操七 含碳化合物利用试验和淀粉水解试验一、含碳化合物的利用试验1、实验目的学会测定某菌能否利用某一含碳化合物
12、的方法。2、原理细菌能否利用某些含碳化合物作为唯一碳源，反映该菌是否含有代谢这种含碳化合物有关的酶，因而可作为鉴定的依据。做这项测定的基础培养基配方很多，因菌的种类而异。培养基可制成液体分装试管，也可加 1.5%2% 水洗琼脂制成平板。可用来测定的底物种类很多，有单糖类、双糖类、糖醇类、脂肪酸类、羟基酸类、各种有机酸类、醇类、各种氨基酸类、胺类以及碳氢化合物等。糖的含量一般为 1%，醇类、酚等底物在培养基中含量一般为 0.1%0.2%，氨基酸的含量一般为 0.5%。因碳氢化合物不溶于水，可在液体中振荡培养或加入 45左右的固体培养基中，用力振荡后立即倒成平板。有些底物不宜加压灭菌，可用过滤法灭
13、菌后加入无菌的基础培养基中，某些醇类和酚类则不需灭菌。3、实验材料(1)菌种大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)。(2)培养基细菌基础培养基( 附录一 5)。试验时，往基础培养基中加糖类 1%或醇、酚0.1%0.2% ，或氨基酸 0.5%。4、方法与步骤将实验菌种首先制成悬液，以避免带入少量碳源而干扰实验结果。平板接种用接种环点种，液体培养用直针接种。每一测定菌都必须接种未加碳水化合物的空白基础培养基作对照。适温培养 2、5、7d 后观察。5、实验结果凡测定菌在有碳水化合物的培养基中的生长情况明显超过在空白基础培养基的生长量者为阳性，否则为阴性。如两种培养基上生长情
14、况差别不明显，可在同一培养基上连续移种三次，如差别仍不明显，则为阴性。二、淀粉水解试验1、实验目的(1)了解淀粉水解试验的原理及用途。(2)学习淀粉水解试验的操作技术。2、原理许多细菌产生淀粉酶，能把培养基中的淀粉水解为无色糊精的等小分子，或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。3、实验材料(1)菌种大肠杆菌(Escherichia coil)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。(2)培养基在肉汤蛋白胨琼脂中添加 0.2的可溶性淀粉，分装， 0.1MPa20min 灭菌。(3)试剂路哥氏碘液(附录 I 一 3.2)。(4)其它酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱
15、等。4、方法与步骤将培养基熔化，倒成平板，凝固后，取菌种点种于平板上，每皿可点 35 个菌，37C 培养 24d，观察结果。5、实验结果取培养好的平皿，在平板上滴加路哥氏碘液以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解，称淀粉水解试验阳性。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。实操八 细胞色素氧化酶试验和尿素酶试验一、细胞色素氧化酶试验1、实验目的(1)了解细胞色素氧化酶试验的用途与原理。(2)学习细胞色素氧化酶试验的操作技术。2、原理在不以氧为直接受氢体的生物氧化体系中,生物氧化需要在多种酶联合作用下方能进行。组成这类生物氧化体系的酶，主要是细胞色素类酶。
16、这种酶在有分子氧与脱氢酶的存在下，可氧化二甲基对苯撑二胺和 萘酚成吲哚酚蓝，其反应式同氧化酶试验。3、实验材料(1)菌种 大肠杆菌(Escherichia)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。(2)试剂 同氧化酶试验。4、方法与步骤取 37培养 20h 的斜面培养物一支，将两种试剂各 23 滴顺斜面从上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂混合液滴在菌落上。5、实验结果在两分钟内呈现蓝色者为阳性，2min 以后出现微弱或可疑反应者均作为阴性结果。二、尿素酶试验1、实验目的(1)了解尿素酶试验的用途及反应原理。(2)学习尿素酶试验的操作技术。2、原理有些细菌具有尿素水解酶，能将培养基中的尿素水解产生碱性物质（碳酸铵） ，使培养基中的指示剂酚红由淡粉红色变成红色。其反应式如下：3、实验材料(1)菌种 大肠杆菌(Escherichia coli)和变形杆菌（Proteus sp.）(2)培养基 尿素酶试验斜面培养基( 附录21)。(3)其它 酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等。4、方法与步骤将待试验菌株接入尿素酶试验斜面培养基中，于 37下恒温培养 24h 后进行观察。五、实验结果培养基变成红色者。表明试验菌有尿素水解酶，或称尿素酶试验阳性，反之为阴性。
