1、1第一天实验时间：2015 年 5 月 23 日实验时间安排：12 级食检 2-3 班：下午 13:00 开始。实验分组：12 组，卫生：第 1、2 组实验内容：见下表。 （先配后包）第 一 组1 .配制磷酸盐缓冲稀释液：所用试剂：磷酸盐缓冲贮存液配制方法：配 1000 mL 磷酸盐缓冲稀释液(用蒸馏水稀释 1.25mL 贮存液到 1000 mL)分装容器：18180 mm 试管、250 mL 三角瓶分装量：9 mL（试管，精确） 、90 mL （三角瓶，精确，内置 10 粒玻珠）分装数量：70 管、26 瓶总配制量：3600 mL高压条件：121，15（大肠菌群培养基）第 二 组1.配制无菌
2、水：所用试剂：蒸馏水 分装容器：500 mL 三角瓶、18180 mm 试管分装量：350 mL、9 mL（试管，精确）分装数量：14 瓶、40 管高压条件：121，152.配制缓冲蛋白胨水（BPW）增菌液：所用试剂：BPW 增菌液 分装容器：250 mL 三角瓶（内放置玻珠 10 粒）分装量：90 mL分装数量：13 瓶总配制量：1200 mL高压条件：121，15（沙门氏菌培养基）第 三 组1.配制月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤：所用试剂：LST 肉汤分装容器：18180 mm 试管分装量：10 mL（带倒管）分装管数：60 管总配制量：700 mL高压条件：121，15（大肠菌群培
3、养基）第 四 组1.包扎 13 个 150 mL 空的三角瓶（加硅胶塞） 、4 个空的白瓷杯、4 个 100 mL 量筒、2 长玻棒（5 支） 、镊子和剪刀 72 套、10 mL 吸管 24 支、涂布棒 36个装入电热干燥箱，进行干热灭菌。 （用棉绳包扎）灭菌条件：150 2 小时。2.包扎枪头盒 14 个（内含 60 支枪头） 。2第 五 组1.配制 EC 肉汤：所用试剂：EC 肉汤分装容器：18180 mm 试管分装量：8 mL（带倒管）分装管数：60 管总配制量：700 mL高压条件：121，15（大肠菌群培养基）第 六 组1.配制煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤：所用试剂：BGLB 肉汤分
4、装容器：18180 mm 试管分装量：10 mL（带倒管）分装管数：60 管总配制量：700 mL高压条件：121，15（大肠菌群培养基）第 七 组1.配制无菌水：所用试剂：蒸馏水 分装容器：250 mL 三角瓶分装量：90 mL（精确，内放置玻珠 10 粒）分装数量：13 瓶高压条件：121，152.配制营养琼脂斜面：所用试剂：营养琼脂分装容器：15150 mm 试管 分装量：4 mL分装管数：55 管总配制量：250 mL高压条件：121，15注：高压后取出摆成斜面备用。（霉菌和酵母菌培养基）第 八 组1.配制孟加拉红培养基：所用试剂：孟加拉红培养基分装容器：250 mL 三角瓶分装量：1
5、00 mL分装管数：13 瓶总配制量：1400 mL高压条件：121，15（霉菌和酵母菌培养基）2.配制胰胨大豆琼脂斜面（TSA）：所用试剂：胰胨大豆琼脂分装容器：15150 mm 试管分装量：4 mL分装管数：55 管总配制量：250 mL高压条件：121，15注：高压后取出摆成斜面备用。（副溶血性弧菌培养基）第 九 组1.配制 EC 肉汤：所用试剂：EC 肉汤分装容器：18180 mm 试管分装量：8 mL（带倒管）分装管数：60 管总配制量：700 mL高压条件：121，15（大肠菌群培养基）第 十 组1.配制平板计数琼脂：所用试剂：平板计数琼脂分装容器：250 mL 三角瓶分装量：15
6、0 mL分装瓶数：13 个总配制量：2100 mL高压条件：121，153第 十一 组1.配制月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤：所用试剂：LST 肉汤分装容器：18180 mm 试管分装量：10 mL（带倒管）分装管数：60 管总配制量：700 mL高压条件：121，15（大肠菌群培养基）第 十二 组1.配制煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤：所用试剂：BGLB 肉汤分装容器：18180 mm 试管分装量：10 mL（带倒管）分装管数：60 管总配制量：700 mL高压条件：121，15（大肠菌群培养基）注意：第 2 组的无菌水用于配制 TTB、BS、DHL、TCBS 培养基；第 4组灭菌的白瓷
7、杯和 100 mL 量筒用于配制以上培养基。带倒管培养基用小灭菌锅效果较好。第二天实验时间：2015 年 5 月 24 日上午实验时间安排：12 级食检 2-3 班：上午第二大节。卫生：第 3 组实验内容1.大肠菌群样品接种：称取样品于磷酸盐缓冲稀释液中稀释到 10-2，10 -3，实验选择稀释度为 10-1，10 -2，10 -3；使用培养基为 LST 肉汤。 （每个稀释度接3 管共 9 试管，361，482 h）2.沙门氏菌样品接种：称取样品于缓冲蛋白胨水增菌液（BP）中进行前增菌 4 h。 （371 ，每组 1 瓶 BP，不用包）3. 第三组配制四硫磺酸盐煌绿（TTB）基础液 ：用第一天
8、的无菌水、量筒、白瓷杯、150 mL 灭菌三角瓶。 （9 瓶，100 mL/瓶）注意：TTB 增菌基础液，上午配好一些，配好后瓶底会有一些白色沉淀。下午实验时间安排：食检 2-3 班：下午 15:10。卫生：第 4、5 组实验内容：1.霉菌和酵母菌样品接种：称取样品于无菌水中，然后按书本方法稀释到10-2， 10-3，实验选择稀释度为 10-1，10 -2，10 -3；使用培养基为孟加拉红。 （每4个稀释度接 2 个平皿共 6 平皿，271 ，722 h）2.配制四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）：TTB 基础液中每 100 mL 加 20%碘液 2 mL、煌绿溶液 0.2 mL。3.沙门氏菌检测
9、：接种 TTB 增菌液。 （吸 10 mL BP 前增菌液，421，202 h，不用包）4. 第四组配制亚硫酸铋琼脂平板（BS） 。 （用灭菌水、灭菌白瓷杯、量筒、玻棒，放冰箱）所用试剂：BS 琼脂；分装容器：培养皿；分装量：1520 mL；分装皿数：5060 个；总配制量：700 mL。 （尽量多制）第三天实验时间：2015 年 5 月 25 日实验时间安排：食检 2-3 班：下午 13:00。卫生：第 6 组实验内容：1.培养基配制（见下表） 。第 一 组1.配制氯化钠多粘菌素 B 肉汤 SPB：所用试剂：氯化钠多粘菌素 B 琼脂基础。每 100 mL 氯化钠多粘菌素 B 琼脂基础加入多粘
10、菌素 B（25000 单位）1 mL。分装容器：1818 0mm 试管分装量：10 mL分装管数：60 管总配制量：700 mL高压条件：121，15（副溶血性弧菌培养基）第 二 组1.配制氯化钠多粘菌素 B 肉汤 SPB：所用试剂：氯化钠多粘菌素 B 琼脂基础。每 100 mL 氯化钠多粘菌素 B 琼脂基础加入多粘菌素 B（25000 单位）1 mL。分装容器：18180 mm 试管分装量：10 mL分装管数：60 管总配制量：700 mL高压条件：121，15（副溶血性弧菌培养基）第 三 组1.配制 BairdParker 培养基：所用试剂：BairdParker 培养基分装容器：250
11、mL 三角瓶分装量：95 mL 分装瓶数：13 个总配制量：1300 mL高压条件：121，15第 四 组1.配制生理盐水：所用试剂：生理盐水（8.5 g NaCl 溶到 1000 mL）分装容器：18180 mm 试管、15150 mm 试管分装量：10 mL、5 mL分装管数：14 管；22 管总配制量：250 mL高压条件：121，15（10mL 管贴标签在试管上）5（金黄色葡萄球菌培养基）（金黄色葡萄球菌培养基）第 五 组1.配制生理盐水：所用试剂：生理盐水（8.5 g NaCl 溶到 1000 mL）分装容器：18180 mm 试管分装量：9 mL分装管数：55 管总配制量：700
12、mL高压条件：121，15（金黄色葡萄球菌培养基）第 六 组1.制胆硫乳琼脂平板（DHL）： 无菌操作所用试剂：DHL 琼脂分装容器：培养皿分装量：20 mL分装皿数：5560 个总配制量：1050 mL（尽量多制）注：勿需高压灭菌2.分配亚硫酸铋琼脂（BS） 、胆硫乳琼脂（DHL）平板：每组每样 45 个。（沙门氏菌培养基）第 七 组1.配制 30 g/L NaCl 稀释水： 所用试剂：NaCl（30 g NaCl 溶到 1000 mL）分装容器：18180 mm 试管、 250 mL 三角瓶分装量：9 mL（试管，精确） 、90 mL（三角瓶，精确，内置 10 粒玻珠）分装量：30 管、1
13、3 瓶总配制量：1500 mL高压条件：121，15（副溶血性弧菌培养基）第 八 组1.配制生理盐水：所用试剂：生理盐水（8.5 g NaCl 溶到 1000 mL）分装容器：250 mL 三角瓶分装量：90 mL（内放置 10 粒玻珠）分装管数：13 瓶（精确）总配制量：1300 mL高压条件：121，15（金黄色葡萄球菌培养基）第 九 组1.配制三糖铁琼脂（TSI）：所用试剂：TSI 琼脂分装容器：15150 mm 试管分装量：6 mL分装管数：55 管总配制量：350 mL第 十 组1.配制氯化钠三糖铁琼脂：所用试剂：氯化钠三糖铁琼脂分装容器：15150 mm 试管分装量：6 mL分装管
14、数：55 管总配制量：350 mL6高压条件：115 ，15注：高压后取出摆成高层斜面备用（沙门氏菌培养基）高压条件： 115，15注：高压后取出摆成高层斜面备用（副溶血性弧菌培养基）第 十一 组1.配制普通肉汤培养基：所用试剂：普通肉汤分装容器：10120 mm 试管分装量：2 mL分装管数：40 管总配制量：100 mL高压条件：121，15（金黄色葡萄球菌培养基）第 十二 组1.配制伊红美蓝（EMB）琼脂：所用试剂：EMB 琼脂分装容器：150 mL 三角瓶分装量：80 mL分装瓶数：13 个总配制量：1100 mL高压条件：121，15（大肠菌群培养基）2.沙门氏菌检测：采用连续划线法
15、接种于亚硫酸铋琼脂平板（BS，4 个平板） 、胆硫乳琼脂平板（DHL，4 个平板）培养基，同时做阳性对照。 （乙型副伤寒沙门氏菌；371，242h ）注意：接种 BS、DHL 培养基可将平板分为两个区，一半做样品，一半做阳性对照。第四天实验时间：2015 年 5 月 26 日实验时间安排：食检 2-3 班：下午 13:00。卫生：第 7、8、9、10 组实验内容1.金黄色葡萄球菌样品接种：称取样品于灭菌生理盐水中稀释；实验选择稀释度为 10-2，10 -3（书上写三个） ；使用培养基为 BairdParker 培养基（将亚碲酸钾卵黄增菌剂摇匀后，加入预热的培养基混匀，倒 6 个平板，吸 1 m
16、L 到3 个平板中涂布，如 0.40.30.3 mL） 。 （ 361，4548 h）2.副溶血性弧菌样品接种：取样样品于 30g/L 氯化钠稀释水中稀释；验选择稀释度为 10-1，10 -2，10 -3；使用培养基为氯化钠多粘菌素 B 肉汤(SPB) 。 （每个稀释度接 3 管，371 ，1824 h）73.沙门氏菌检测：从亚硫酸铋琼脂（BS） 、胆硫乳琼脂（DHL） 、亚利桑那琼脂（SA） 中各取可疑菌落接种于三糖铁（TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶培养基（LD ，接种后要滴加液体石蜡 25L 封液面）和尿素酶中；接种时接种一管阳性对照。 （371 ， 242 h）4.大肠菌群检测：观察 LST
17、 产气情况，并将产气管接种到 BGLB（361，482 h）和 EC 肉汤。 （ 44.50.5，242 h ）第五天实验时间：2015 年 5 月 27 日实验时间安排：食检 2-3 班：下午 13:00。卫生：第 11、12 组实验内容：1.第五组配制 TCBS 琼脂平板，无菌操作倒平板。 （每组 45 个平板，尽量多制）2.沙门氏菌检测：观察并记录三糖铁（TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶（LD）培养基、尿素酶的现象，并根据书中表格判断结果。将可疑三糖铁（TSI）琼脂培养物用接种针接种 V-P 半固体、氰化钾生长管及对照管 (滴加液体石蜡25L)、吲哚培养基（色氨酸肉汤） 、丙二酸钠和卫矛醇生化
18、管，各接一管阳性对照。 （371 ，242 h）83.粪大肠菌群检测：记录 EC 肉汤产气情况，记录粪大肠菌群结果。并将EC 肉汤再培养 1 天。 （44.50.5 ，242 h）4.副溶血性弧菌检测：接种 TCBS 琼脂平板（选择 3 个有菌生长的最高稀释度氯化钠多粘菌素 B 肉汤（SPB）采用连续划线法接种，并接种阳性对照。（371 ，1824 h）5.真菌菌落计数观察：通常选择菌落数在 10150 之间的平皿进行计数，同稀释度的 2 个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）检样中所含霉菌和酵母数。注意：沙门氏菌三糖铁（TSI）琼脂已培养 1824 h，此时进行镜检最好。一般细菌
19、培养 1824 h 时是镜检的最佳时期，但由于时间太紧，放在后面做，要保留三糖铁（TSI）琼脂。第六天实验时间：2015 年 5 月 28 日实验时间安排：食检 2-3 班：下午 13:00。卫生：第 1、2、3、4、5 组实验内容：1.平板计数接种：称取样品于磷酸盐缓冲稀释液中稀释；实验选择稀释度为 10-3，10 -4；使用培养基为平板计数琼脂 。 （已放 45水浴中保温，倒 4 平板，一个稀释度做 2 个平板；361 ，482 h）2.环境平板计数：采样部位为手，面积为 50 平方厘米，涂抹 2 次分别放入生理盐水中稀释；实验选择稀释度为 10-2， 10-3；使用培养基为平板计数琼脂。
20、（已放 45水浴中保温，倒 4 平板，每个稀释度做 2 个平板，361，482 h）3.金黄色葡萄球菌检测：观察 BairdParker 平板结果，记录菌落数目，并9将可疑菌落接种普通肉汤培养基，同时作阳性对照。 （361，2024 h）4.大肠菌群检测：观察 BGLB 产气情况，记录大肠菌群结果。并将产气EC 肉汤管采用连续划线法接种到 EMB 平板，并做阳性对照。 （EMB 每组一瓶，倒 4 个平板，361 ， 242 h）5.副溶血性弧菌检测：接种 TCBS 琼脂平板上可疑菌落接种到无盐胰胨水、30g/L 氯化钠胰胨水和 氯化钠三糖铁培养基 中。 （371，1824 h）6.沙门氏菌检测
21、：A.观察生化管结果，使用试剂有 V-P 甲乙液（V-P 试验）和柯凡克试剂（Kovacs ，吲哚试验） ；B. 凝集试验和血清学试验：从三糖铁（TSI）琼脂斜面挑菌进行试验。注意：1.TCBS 琼脂平板上生长的菌落多为黄色菌落，即为溶藻胶弧菌，因有鞭毛，蔓延很厉害。有的甚至将副溶血性弧菌盖住。不易观察。2.若每个浓度均有可疑菌落，接种无盐胰胨水、30 g/L 氯化钠胰胨水和氯化钠三糖铁培养基时，可每个浓度挑一管。若只有一两管可疑，就只做这几管即可，同时应做阳性对照。3.如金黄色葡萄球菌 10-1 菌太多，可不数，直接数 10-2 的三个平板相加计数。若平板上菌落不均匀或聚集，为未涂布均匀，可
22、挑取均匀的部分数平板的1/2，再乘以 2，三个平板相加计数。有时平板上会有不止一种菌落特征，每种都应接种普通肉汤培养基，必须接种一管阳性对照或每 2 组接种一个阳性对照。4.接种 EMB 平板的方法与接种 TCBS 琼脂平板相同。5.使用试剂有 VP 试剂和柯凡克试剂按说明书滴加。6.要保留三糖铁（TSI）琼脂后面做镜检。第七天实验时间：2015 年 5 月 29 日实验时间安排：食检 2-3 班：下午 13:00。卫生：第 6、7、8 组实验内容：1.金黄色葡萄球菌检测：血浆凝固酶试验。 （从普通肉汤培养基中吸 0.3 mL培养液到含 0.5 mL 灭菌生理盐水的冻干血浆中，361，不少于
23、6 h）2.大肠菌群检测：从用接种环在 EMB 平板挑取可疑菌落划线接种到营养琼脂斜面，同时接种阳性对照一管。 （361 ，1824 h）3.副溶血性弧菌检测：A 在 30 g/L 氯化钠胰胨水中生长旺盛菌株进行革兰氏染色、镜检。B 生化鉴定：取一环 30 g/L 氯化钠胰胨水培养物接种到 70 g/L 氯化钠胰胨水、100 g/L 氯化钠胰胨水和 胰胨大豆琼脂斜面上；在 30 g/L10氯化钠胰胨水培养物中加入靛基质试剂（Kovacs 试剂） ，观察结果。C 将氯化钠三糖铁培养基培养物用接种针分别接种到 3.5%氯化钠赖氨酸脱羧酶、3.5% 氯化钠氨基酸脱羧酶对照、3.5%氯化钠精氨酸双水解
24、酶（接种后各滴加液体石蜡25L 封液面）和 3.5%氯化钠 V-P 半固体琼脂。 （371 ，24 h）4.沙门氏菌检测：对符合书表 5 中类别 2 中的生化试验和血清学试验的进行革兰氏染色、镜检。 （三糖铁（TSI）琼脂斜面中取菌，先做片，不观察）注意：1.从液体培养基中挑取菌液要用接种环，因为接种针挑的太少（液体培养基中含菌体没有固体中多） 。2.不直接用 EMB 平板进行镜检，而要再接种营养琼脂斜面，时为了防止EMB 平板的颜色对镜检的影响。可用普通肉汤培养物 进行镜检。3.要保留氯化钠三糖铁培养基和三糖铁（TSI）琼脂，以便后面镜检。4.革兰氏染色：先再玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用
25、接种环取菌少许与水滴混合均匀，涂成一薄层，直径大约 1 厘米，用酒精灯干躁。初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。脱色：连续滴加 95%乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。复染：加番红（沙黄）染色 1 分钟，水洗。革兰氏染色的关键是一定要控制好脱色的时间，其他步骤的时间都没有那么严格。革兰氏阳性菌：紫色；革兰氏阴性菌：红色。第八天实验时间：2015 年 5 月 30 日实验时间安排：食检 2-3 班：下午 13:00。卫生：第 9、10 组实验内容：1.平板计数结果记录；霉菌和酵母菌结果记录。2.金黄色葡萄球菌检测：观察血浆凝固酶试验结果；革兰氏
26、染色、镜检。结果记录。3.大肠杆菌检测：A.生化鉴定：将营养琼脂斜面培养物接种到色氨酸肉汤（361 ，242 h） 、MR-VP 培养基（2 套，361，482 h）和 Korse 氏枸橼盐肉汤（361 ，96 h） ；B. 革兰氏染色、镜检。114.副溶血性弧菌检测：观察生化鉴定结果（细胞色素氧化酶试剂甲乙液和V-P 试剂甲乙液） ；革兰氏染色、镜检。注意：1.金黄色葡萄球菌革兰氏染色、镜检用阳性对照菌悬液。2.细胞色素氧化酶试剂配制：现配（甲液：10 g/L -萘酚乙醇溶液，乙液：10 g/L 盐酸四甲基对苯二胺水溶液） ；观察时，各滴 23 滴，从胰胨大豆琼脂斜面上端流下，2 min 内呈现蓝色者为阳性（国标为 10 秒钟内出现为极阳性） 。显色很快。3.平板计数如果 10-2， 10-3 菌落太多可如此计数。 （只计 10-4 结果）取 1/4 计数4 对角计数4 非对角计数4第九天实验时间：2015 年 5 月 31 日实验时间安排：食检 2-3 班：上午 9:30。卫生：第 11、12 组实验内容：1.大肠杆菌检测：观察生化鉴定结果。 （V-P 试剂甲乙液、甲基红试剂和柯凡克（Kovacs）试剂）
