1、一株乳酸菌产类细菌素 Enteriocin LK-S1 的初步研究王云华 李 健 *(山东大学，山东 济南 250100)摘要: 从鸡肠道分离的 59 株乳酸菌中，通过双层平板法试验，筛选出一株产类细菌素的乳酸菌，编号为 SE-81。初步鉴定为肠球菌属（ Enterococcus） 。在排除有机酸和过氧化氢的干扰作用后，SE-81 菌株对溶壁微球菌（ Micrococcus lysodeikticus） 、金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）和枯草杆菌（ Bacillus subtilis）等革兰氏阳性菌和大肠杆菌（ Escherichia coli）及鼠伤寒沙门氏菌
2、（ Salmonella typhimurium）等革兰氏阴性菌有强烈的抑制作用。用胰蛋白酶处理发酵上清液后，抑菌活性丧失。因此初步认为该菌株产生一类具有广谱抑菌活性的类细菌素物质，命名为 EnteriocinLK-S1。它具有较广的抗菌谱，作用 pH 在 4.0-6.0，有很好的热稳定性。关键词: 肠球菌；类细菌素；乳酸菌；生物学特性中图分类号: Q933 文献标识码: A乳酸菌(Lactic acid bacteria LAB)是一类利用可发酵糖并产生大量乳酸的细菌的统称。长期以来，乳酸菌广泛应用于乳制品、蔬菜及肉制品的发酵和防腐中 1。许多乳酸菌代谢除了产生乳酸、乙酸等有机酸和过氧化氢外
3、，还能产生多种具有*联系作者收稿日期: 2001-11-18作者简介: 王云华(1979-), 女, 硕士生一株乳酸菌产类细菌素 Enteriocin LK-S1 的初步研究2抑菌或杀菌生物活性的细菌素（bacteriocin） ，在抑制多种病原微生物和食物腐败菌等方面具有重要的作用 2，其中以乳链球菌肽 Nisin 为代表。细菌素是细菌在代谢过程中由核糖体合成的具有抑菌活性的多肽或蛋白质。但它通常具有较为窄谱的抑菌活性 3，仅仅抑制其亲缘关系很近的乳酸菌株和非乳酸菌的革兰氏阳性细菌，对革兰氏阴性细菌和真菌则无效。类细菌素是用来描述那些不符合或不完全符合细菌素定义的拮抗物质。类细菌素不仅能抑制
4、革兰氏阳性菌，而且对革兰氏阴性菌和真菌也有抑制作用 4。这一特性决定了类细菌素具有比细菌素更为广泛的应用前景。目前关于乳酸菌产生细菌素的研究已深入到分子水平，而对乳酸菌类细菌素的研究却很少，国内尚未见报道。本文对 59 株乳酸菌株进行了筛选，得到一株产类细菌素的菌株，该菌株是自鸡肠道中分离得到的，经鉴定为肠球菌，并对它产生的类细菌素 EnteriocinLK-S1 的生物学特性进行了研究。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌种Enterococcus SE-81：自鸡肠道中分离得到抑菌试验中的指示菌：溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、金黄色葡萄球菌(Stap
5、hylococcus aureus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、 乳酸乳球菌(Lactococcus lactic) 、干酪乳球菌（ Lactococcus casei） 、大肠杆菌(Escherichia.coli)、 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、海洋假单胞菌(Pseudomonas sp.)、黑曲霉（Aspergillus niger）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）均为实验室保存。1.1.2 培养基BCP 培养基和 MRS 培养基参照文献5 配制指示菌生长培养基：LB、PDA 和 MA 参照文献6配制
6、抑菌活性检测用底层培养基：指示菌生长培养基加入琼脂 2% 抑菌活性检测用上层培养基：指示菌生长培养基加入琼脂 0.75%1.2 分析方法1.2.1 乳酸的定量分析：采用 40B 型葡萄糖-乳酸分析仪（山东省省科学院） 1.2.2 EnteriocinLK-S1 的制备：培养 24h 的发酵液，离心（8000rpm）去菌体，经过滤除菌得到发酵上清液。再经真空冷冻干燥成为干粉，即为类细菌素粗制品。用时以原体积 1/5 的无菌水重新溶解。1.2.3 细菌数的测定：用血球计数板计数和平板统计菌落数（CFU/ml）一株乳酸菌产类细菌素 Enteriocin LK-S1 的初步研究31.2.4 抑菌试验：
7、牛津杯双层平板法。将各指示菌培养到指数期，经无菌水系列稀释到 8.0108CFU/ml，取 100ul 加入到 4.5ml 上层培养基中，振荡混匀，然后倒入预先准备的装有 10ml 底层培养基的平板上。向牛津小杯中加入 0.15ml 乳酸菌发酵浓缩液，平板在室温下扩散 3h，于 38下培养 12h，测抑菌圈的直径。1.2.5 排除干扰因素：采用中和法排除有机酸的干扰；加入适量的过氧化氢酶（1mg/ml） ，37水浴保温 1h，排除过氧化氢的抑菌作用。2 实验结果2.1 产类细菌素菌株的筛选和菌种分离鉴定采用平板稀释法和厌氧培养技术，从鸡肠道中分离经纯化得到 59 株乳酸菌；通过牛津杯双层平板法
8、，筛到一株编号为 SE-81，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有抑制作用的菌株，结果见图 1；对其进行形态观察和生理生化性质测定，菌体细胞呈球形，单个或成双、四联球体出现；革兰氏阳性，无芽孢，菌落边缘整齐，光滑，乳白色不透明；接触酶反应、硝酸还原试验、水解淀粉试验、水解明胶试验、柠檬酸生长试验、H2S 产生试验和产生吲哚试验均为阴性；发酵葡萄糖、麦芽糖、果糖、核糖和葡萄糖酸钠产酸，但发酵葡萄糖和葡萄糖酸钠均不产气，属于异型发酵，发酵棉子糖、蜜二糖、纤维二糖、乳糖、半乳糖、甘露糖和山梨醇，不发酵鼠李糖和岩藻糖，弱发酵阿拉伯糖、松三糖、木糖和七叶灵；1045均生长。根据 SE-81 菌株的形态特
9、征及生理生化特性，参照伯杰氏细菌鉴定手册 （第八版）和乳酸菌分类鉴定及实验方法7 ，初步鉴定为肠球菌属（ Enterococcus） 。2.2 SE-81 菌株所产抑菌物质的确定2.2.1 酸性末端产物的排除肠球菌 SE-81 发酵液的上清液对指示菌的抑制作用，可能是它代谢合成的细菌素，也可能是酸性末端产物如乙酸、乳酸及其它有机酸作用的结果。为了排除酸性末端产物的干扰，将培养 24h 菌株发酵液离心，取上清液，中和至 pH5.0 后，进行抑菌试验(以溶壁微球菌为指示菌 )，以 pH5.0 乳酸和乙酸为对照。重复三次，抑菌结果如 表 1 所示。表 1 排除有机酸的抑菌试验结果Table 1 Re
10、sults of antibacterial by supernatant without organic acid一株乳酸菌产类细菌素 Enteriocin LK-S1 的初步研究4样品 抑菌圈平均直径(mm)发酵上清液 23.28pH 为 5.0 的发酵液 15.10pH 为 5.0 的乳酸 pH 为 5.0 的乙酸 注: 不抑制 No inhibitory结果表明，pH5.0 的乳酸和乙酸不能抑制指示菌的生长，相反 pH 为 5.0 的发酵上清液对指示菌仍具有强烈的抑制作用，这说明在排除有机酸的干扰后，发酵液中存在其他的抑菌物质。2.2.2 过氧化氢干扰的排除乳酸菌代谢产生的过氧化氢也可
11、以抑制细菌的生长，尤其是抑制革兰氏阴性细菌的生长，因此必须排除过氧化氢的干扰。取 1ml 发酵浓缩液，加入 10mg/ml 的过氧化氢酶液 1ml，在 30水浴反应 60 分钟，进行抑菌试验，以大肠杆菌（E.coli）为指示菌。以未经过氧化氢酶作用的发酵上清液为对照，重复三次，抑菌结果如表 2 所示。从表 2 中可以看出，经过氧化氢酶处理的发酵液的抑菌作用几乎没有变化，这表明发酵浓缩液抑制革兰氏阴性细菌的作用并不是过氧化氢作用的结果。表 2 过氧化氢酶处理后的抑菌试验结果Table 2 Results of antibacterial after treatment with hydrogen
12、 peroxidase样品 抑菌圈平均直径(mm) 活性下降百分率(%)对照 20.34 0.00过氧化氢酶处理的发酵液 19.42 4.502.2.3 蛋白酶处理法取两份等量（1ml）的 SE-81 发酵浓缩液，用 1mol/L 的 HCl 和 2mol/L NaOH 调节其 pH 至胰蛋白酶作用的最适 pH 值 7.6 ，分别加入 0.5mg 的胰蛋白酶和无菌水，37水浴中温育 1h，再将 pH 值调回到类细菌素的最适 pH，并与未经任何处理的原液作比较，进行抑菌试验，结果如图 2 所示。一株乳酸菌产类细菌素 Enteriocin LK-S1 的初步研究5从图 2 中可知，经胰蛋白酶处理的
13、发酵浓缩液丧失抑菌活性。这证实了肠球菌SE-81 产生的抑菌物质是一种蛋白质或多肽，并对胰蛋白酶敏感。 该菌株所产的抑菌物质，可抑制革兰氏阳性菌，也可以抑制革兰氏阴性菌，而且这种抑菌结果，排除是有机酸和过氧化氢所为，再加上对胰蛋白酶敏感，因此可图 1SE-81 发酵液的抑菌试验结果Figure. 1 Results of antibacterial from SE-81 supernatant 1 指示菌为大肠杆菌2 指示菌为溶壁微球菌图 2 胰蛋白酶处理后抑菌试验结果Figure. 2 Results of antibacterial from supernatant after treat
14、ment with trypsin1 SE-81 发酵液2 经胰蛋白酶作用的发酵液3 加入无菌水的发酵液一株乳酸菌产类细菌素 Enteriocin LK-S1 的初步研究6认为是一种类细菌素，命名为 EnteriocinLK-S1。下面对 EnteriocinLK-S1 粗制品的生物学性质进行了初步的研究。3 讨论自鸡肠道中分离得到的能够抑制其他细菌生长的乳酸菌是改善鸡肠微生态环境的最适益生菌。由于这些乳酸菌已经完全适应鸡肠道的生态条件，因此比从其他生境中分离的乳酸菌更有优势。故我们对从鸡肠道分离得到的 59 株乳酸菌进行了抑菌试验，结果从中筛选出一株有抑菌活性的肠球菌 SE-81。众所周知，
15、乳酸菌通过代谢合成有机酸、过氧化氢以及细菌素等化合物的途径来抑制其他微生物的生长和繁殖，因此在食品防腐方面有重要的应用前景。但研究报道的大多是乳酸菌产生仅仅抑制同种的或亲缘关系很近的乳酸菌和以溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性细菌的细菌素，关于乳酸菌抑制革兰氏阴性菌和真菌的报道很少。如 Virginia 等 1999 年报道从健康成年妇女阴道中分离得到一株产类细菌素的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，能够杀死革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌4。参考文献：1. Daeschel MA. Antimicrobial Substances from lactic
16、 acid bacteria for use as food preservatives J . Food Technol . 1989; 43: 1641712. 朱文淼, 刘稳. 乳酸菌细菌素的研究动向 J . 生物技术, 1999; 9(6): 32363. 杨杰彬等. 乳酸菌-生物学基础及应用 M . 北京 : 中国轻工业出版社, 1996. 2412464. Virginia S. Characterization of a Bacteriocin-like Substance produced by a vaginal Lactobacillus salivarius Strain J . Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65: 563156355. 孔健，马桂荣等. SL 益生素生产菌乳链球菌若干特性 J . 微生物学报 1996; 12(4): 4544596. 白毓谦，方善康等编. 微生物学实验技术 M . 山东 : 山东大学出版社, 1986. 4697. 凌代文，东秀珠. 乳酸菌分类鉴定及实验方法 M . 北京: 中国轻工业出版社, 1999. 3845
