1、 网址： 第 1 页，共 4 页抗中性粒细胞胞浆抗体在系统性红斑狼疮中的临床意义抗中性粒细胞胞浆抗体在系统性红斑狼疮中的临床意义中华皮肤科杂志 1999 年第 1 期第 32 卷 论 著作者：罗婷 赵明辉 马圣清单位：罗婷、马圣清(100034 北京医科大学第一医院皮肤科) ；赵明辉(肾脏内科)关键词： 红斑狼疮；系统性；抗中性粒细胞胞浆抗体【摘要】 目的 为了探讨抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)在系统性红斑狼疮(SLE)中的临床意义。方法 通过间接免疫荧光(IIF)、酶联免疫吸附试验和免疫印迹方法检测了 84 份 SLE 患者血清 ANCA 的阳性率和 6 种已知的靶抗原：蛋白酶 3、髓过氧
2、化物酶、杀菌通透性增高蛋白、弹力蛋白酶、组蛋白酶 G 和乳铁蛋白。结果 间接免疫荧光法检测 ANCA 在 SLE 中的阳性率是 22.6，均为核周型 ANCA；分别有 44.1和 14.3的 SLE 患者血清含有抗组蛋白酶 G 和乳铁蛋白自身抗体，且活动期的阳性率明显高于稳定期。结论 组蛋白酶 G 为 ANCA 的主要靶抗原，且抗组蛋白酶 G 抗体与 SLE 的病情活动有关。Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies and Their Target Antigens in Patients with Systemic Lupus ErythematosusLU
3、O Ting, ZHAO Minghui, MA Shengqing. department of Dermatology, First Teaching Hospital, Beijing Medical University, beijing 100034【Abstract】 Objective To investigate the clinical significance of antineutrophil cytoplasmic antibodies(ANCA ) and their target antigens in systemic lupus erythematosus(SL
4、E).Methods 84 serum samples were collected,and indirect immunofluorescence(IIF) and ELISA were used to detect the positive rates of ANCA and 6 known target antigen, the 6 specific ANCA antigens included proteinase 3 (PR3), myeloperoxidase (MPO), bactericidal/permeability-increasing protein(BPI), hum
5、an leukocyte elastase(HLE), cathepsin G(CG) and lactoferrin(LF). Positive sera were furthur studied by Western blot analysis. The positive rate of ANCA was also compared between patients with (n=50) and without (n=34) lupus activities to reveal whether ANCA were correlated with lupus activities.Resu
6、lts 22.6 sera showed ANCA positive by IIF method, and all of them were peripheral nuclear aNCA. However, ELISA testing showed that 44.1 and 14.3 sera recognized CG and LF, respectively. The positive rates of anti-CG, and anti-LF antibodies in patients with active lupus were significantly higher than
7、 those in non-active patients (P 0.001).Conclusion The target antigen of ANCA in SLE patients was CG, and anti-CG antibodies might be correlated with lupus activities.【Key words】 Lupus erythematosus, systemicAntineutrophil cytoplasmic antibodies抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体。有研究报道在系网址： 第
8、2 页，共 4 页统性红斑狼疮(SLE)中 ANCA 有一定的阳性率，但是文献中对靶抗原的报道并不一致，对 ANCA 在 SLE 中的临床意义也有争议。为此，我们检测了 84 份 SLE 患者血清中 6 种已知的 ANCA 靶抗原和阳性率，并且初步探讨了 ANCA 在 SLE 中的临床意义。材料和方法一、临床资料84 份 SLE 患者血清采自 1992 年 1 月至 1997 年 8 月我科就诊的患者。所有病例均符合美国风湿病协会制定的诊断标准。根据 Urowitz 等提出的狼疮活动性标准分为活动期和稳定期，其中活动期血清 50 份，稳定期血清 34 份。58 份正常人血清为对照。二、实验方法
9、1.间接免疫荧光法(IIF)：从正常人静脉抗凝血中分离白细胞为底物进行 IIF 检测。制备底物的方法简述如下：健康人肝素抗凝血 10mL，加预冷的 4 倍红细胞溶解液(0.83 nH4Cl 10mmol/L KHCO3 0.1mmol/L EDTA)。置冰盒 10min 后离心 1500r/min，10min，弃上清液，收集底部细胞层。0.01mol/L pBS 洗 2 次后，置含 5胎牛血清的 RPMI1640 培养液调细胞浓度为 106/mL。细胞离心机(Shadon)甩片，纯酒精(4预冷)固定5min，20 保存备用。IIF 结果判定中性粒细胞胞浆内呈亮绿色荧光，在细胞核核叶之间有重染者
10、为胞浆型 ANCA(c-ANCA)；荧光着色环绕细胞核周围则为核周型 ANCA(p-ANCA)。2.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测 ANCA：参照 Wiik。6 种特异性抗原：蛋白酶 3、髓过氧化物酶、杀菌通透性增高蛋白、弹力蛋白酶、组蛋白酶 G 和乳铁蛋白分别用 0.05mol/L 碳酸盐(pH9.6)缓冲液(BPI 则用0.01mol/L pBS 缓冲液) 稀释后包被酶标板，终浓度为 12g/mL 。 2 检验比较 SLE 活动期与稳定期两组患者 ANCA 的阳性率。3.免疫印迹法测定 ANCA：1 中性粒细胞粗抗原的制备：参照文献。取健康人的肝素抗凝血 200ml，加预冷的 4 倍红
11、细胞溶解液；4，10min 后离心，1500r/min,10min，弃上清液。底部沉淀打匀后，重复上述步骤一次。预冷的 PBS 缓冲液清洗 2 次。加 0.2mol/L 醋酸钠(pH4.2)10mL,PMSF(Sigma)终浓度 1mmol/mL。超声细胞粉碎机粉碎细胞(共 10 次，每次 30s，中间间隔 30s，冰浴中进行)；4 ，12000r/min ，离心20min；测上清液中的蛋白浓度；将上清液分装入 Ependorf 管，冷冻干燥，20保存备用。2 免疫印迹法：参照文献。结果1.IIF 法： 84 份 SLE 患者血清， 19 份阳性，均为 p-ANCA，阳性率 22.6。2.EL
12、ISA 法：84 份 SLE 血清中无 1 例识别蛋白酶 3、髓过氧化物酶或杀菌通透性增高蛋白，只有 2 份识别弹力蛋白，12 份识别乳铁蛋白(14.3)，37 份识别组蛋白酶 G(44.0)。50 份活动期血清中，10 份乳铁蛋白阳性(20.0)，29 份组蛋白酶 G 阳性(58.0) ；而 34 份稳定期血清分别只有 2 份乳铁蛋白阳性(5.9) ，8份组蛋白酶 G 阳性(23.5 )，经 2 检验，两者具有显著性的差异(P0.01) 。3.免疫印迹法：阳性血清相对分子质量为 29 000、78 000 的蛋白条带，分别是特异性抗原组蛋白酶 G 和乳铁蛋白。网址： 第 3 页，共 4 页讨
13、论ANCA 是近 10 年来国际上血管炎研究领域的一大热点。研究表明，不同的 ANCA 类型和靶抗原往往与临床上不同的疾病相关。虽然有研究报道 SLE 中 ANCA 有一定的阳性率，但是对靶抗原和其中的临床意义存在争议。通常用 IIF 法检测 ANCA 分为两种类型：胞浆型 ANCA，其靶抗原主要是 PR3，还有一部分是 BPI；核周型 ANCA，其靶抗原主要是髓过氧化物酶，还有组蛋白酶 G、弹力蛋白酶和乳铁蛋白等。近年来，有关 ANCA 在 SLE 中的研究涉及了检测方法、特异性靶抗原、临床意义等各个方面。由于 SLE 中ANA 的阳性率很高，与 p-ANCA 很难区别。应注意选用淋巴细胞为
14、底物作内参照。ANA 不仅可识别外周血单一核细胞，也识别淋巴细胞，而 p-ANCA 不识别淋巴细胞内的成分。但是，当 ANA 和 ANCA 同时阳性时，ANA 的荧光很强可掩盖 ANCA，与 p-ANCA 区分很困难。本研究中 IIF 法的阳性率仅为 22.6，明显低于ELISA 法。因此应用 IIF 法检测 SLE 患者的 ANCA 仅可作为过筛，要通过 ELISA 法明确靶抗原。本研究检测了 ANCA 的 6 种已知抗原，84 份 SLE 血清无 1 例识别髓过氧化物酶、杀菌通透性增高蛋白，只有 2 例弹力蛋白酶阳性，有 12 例乳铁蛋白阳性(14.3) ，37 例组蛋白酶 G 阳性(44
15、.0 )，说明 SLE 中ANCA 的靶抗原主要是组蛋白酶 G 和乳铁蛋白。并且活动期组蛋白酶 G 和乳铁蛋白的阳性率明显高于稳定期。本组资料未发现 ANCA 阳性与重要器官如肾脏受累有关；患者病程中出现皮肤血管炎改变与 ANCA 阳性也无明显关系。本组资料表明，IIF 法检测 SLE 患者血清中 p-ANCA 的阳性率是 22.6，未见 c-ANCA；特异性靶抗原主要是组蛋白酶 G 和乳铁蛋白，组蛋白酶 G 的阳性率可达到 44.0。我们进一步发现 SLE 病情活动期组蛋白酶 G 和乳铁蛋白的阳性率明显高于稳定期，提示抗组蛋白酶 G 和乳铁蛋白自身抗体可能与SLE 的病情活动有关。参 考 文
16、 献Spronk PE, Bootsma H, Horst G, et al. antineutrophil cytoplasmic antibodies in systemic lupus erythematosus. Br J rheumatol, 1996,35:625-631.Schnabel A, Csernok E, Isenberg DA, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies in systemic lupus erythematosus: prevalence, speceficities, and clinical sig
17、nificance. Arthritis Rheum, 1995,38:633-637.蒋明, 朱立平 , 林孝义主编. 风湿病学. 第 1 版. 北京:科学出版社,1995.1037.Wiik A, Rasmussen N, Wieslander J. Methods to detect autoantibodies to neutrophilic granulocytes. Manual Biol Markers Dis, 1993;A9:1-14.Zhao MH, Jones SJ, Lockwood CM. Bactericidal/permeability-increasing pr
18、otein (BPI) is an important antigen for anti-neutrophil cytoplasmic antibodies(ANCA) in vasculitis. Clin Exp Immunol, 1995,99:49-56.Gross WL, Csernok E, Helmchen U. Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies, autoantigen, and systemic vasculitis (Review). APMIS,1995,103:81-97.(收稿：19980313 修回：19980820)网址： 第 4 页，共 4 页
