酶标仪常见技术和应用.pdf

1、2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 酶标仪常见技术和应用 尹迪 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devic

2、es, LLC or their respective owners. 酶标仪工作原理及应用范围 光吸收检测技术原理及常见应用 荧光检测技术原理、分类及常见应用 化学分光技术检测原理及常见应用 Alpha 技术特点 Agenda 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 工作原理 为 一台升级版 的 分光光度计 酶 标

3、 仪工作原理 不同物质对 特点波长光 吸收值 1.紫外可见分光光度计 2.可见分光光度计 3.紫外分光光度计 4.荧光分光光度计 5.近红外分光光度计 6.红外分光光度计 7.双光束紫外可见分光光度计 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 酶 标仪与分光光度计 的 不同 ？ 1:通量 上 支持6 、12、24、48

4、、96、384孔 板，高 端酶标 仪 可达到3456孔板 2:功能 上 单功能酶标仪（吸收光、 荧光、 化学发 光） 多功能酶标仪 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 酶标仪多功能微孔板读板机 （仪 ） 学名：微孔读板机（仪） Microplate Reader 俗称：国内俗称酶标仪，因早期主要用于酶联免疫检 测

5、（ELISA ），故久之习称为酶标仪 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 酶标仪能做什么？ 凡是与光信号相关 的 实验、需要高通量、需要节省试 剂的实验 且 可以转移 到 微孔 板 中液体物质 都 可以考虑使 用微孔板检测仪（酶 标 仪）进行信号检 测！ 21/02/2014 2012 For research

6、use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 目前中国市场主要几个酶标仪厂 家 产品线丰富（高中低，Multi-mode 11 、Single-mode 9 ） 新产品推出速度快（Paradigm 、I3+ MinMax 、I3+ Scanlater ） 品牌知名度高、市场占有率大 MD 主要竞争对手（Multi-mode 8 、Single-mode 10

7、 ） 新产品推出紧随MD （如Cytation3 对应I3 、Neo对应 Paradigm ） 产地瑞士、在欧洲及北美有较高知名度 （Multi-mode 3 、Single-mode 3 ） 最近无新产品推出，进入中国较早，在东北地区用户较多 主要产品非酶标仪（Multi-mode 3 、Single-mode 10 ） 最近无心产品推出 具有专利Alpha技术，但没有型号支持HTRF 技术（认证） 主要产品非酶标仪（Multi-mode 4 、Single-mode 2 ） 多功能酶标仪（覆盖全波长）仅一款VF，只有四功能 无最新产品问世 2012 For research use onl

8、y. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 光吸收检测技术原理 透射 率 和 吸光度 I0 = Ia + It + Ir 入射光强度为 I0 ，吸收光强度为Ia ，透过光强度为It ，反射光强度 为Ir 因为反射光强度Ir 由微孔板材料决定 I0 = Ia + It 朗伯比尔定律 K 摩尔吸光系数、a 吸光系数, 根据C 单位 决定 透射率 吸收值 2012 For r

9、esearch use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 光波长范围 21/02/2014 多数低端单功能酶标仪光谱范围（400-750nm ） 中、高端单功能或多功能光谱范围（200-1000nm ） 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks

10、 mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. Comparison of Microplate Readers with Absorbance Detection 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective own

11、ers. 物质最佳吸收波长 不同物质有不同吸收峰，有些实验检 测物质 需要更 宽的波 长 范围 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 光吸收的基本检测类型 特定波长检测: DNA 、RNA及蛋白质浓度 比色测定: 检测反应的产物产生的颜色变化（450nm ） 酶联免疫吸附试验 （ELISA ） 浊度检测: 检测样品

12、中微颗粒产生的光的散射 细菌的生长（600nm ） 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 光吸收检测常见应用 利用光吸收原理最常见的几种生物学实验 DNA/RNA含量检测 常用于快速检测质粒DNA 浓度 ELISA （酶联免疫吸附试验）检测 方法多（间接法、竞争法、双抗夹心法等）、应用广 细胞活力检测 MTT 、X

13、TT 等 酶活动力学检测 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. DNA 、RNA或蛋白 浓度检 测 DNA双螺旋中碱基 蛋白质酪氨酸 、 色氨酸、苯丙 氨酸成 分含量 A = a * c * l a = 物质消光系数 c = 浓度 l= 光 径（0.5mm 或者1mm ） SMP软件自动给出 DNA浓度：OD260

14、=1表示 50 g/ml双链DNA(dsDNA) DNA纯度：纯度计算(OD260/OD280) DNA 纯品: OD260/OD280 = 1.8 决定上 样体积 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 加入底物 显色反应 阳性样品 阴性样品 反应原理 最 常见应用类型- ELISA（酶联免疫吸附试验）实 验 20

15、12 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 酶 决定底物 类型 碱 性 磷酸酶 （AP ） 常用底物：PNPP 405nm 特点：本 底低 ，灵敏度 高， 较昂贵 辣 根 过氧化 物酶(HRP) 底物：ABTS 410/650nm OPD 492nm TMB 450nm 特点：常 用， 灵敏度不 如AP系统 全波长带来优势E

16、LISA 不 同颜色 需不同 波长 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 细胞活力检测 MTT- 黄色染料 被活体细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原 形成蓝紫色结晶-甲瓒 DMSO溶解 检测OD570(OD630 作为背景参照） cell 细胞质 细胞核 线粒体 细胞活性检测 MTT 、XTT 法 2012 For r

17、esearch use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 酶活力分析 酶活性分析：就是 指在一定条件下，通过连续 测定酶的吸光值， 从而达到动态监测酶活性的 一个过程。 乳酸脱氢酶 （ LDH ）活 性检测 -半乳糖苷酶检测 血清心肌酶活性检测 脱氢酶活性检测 2012 For research use only. Not for use in diag

18、nostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 光吸收法优缺点 优点： 灵敏、特异、简单、快速、对环境没有污染、稳定及 易于自动化操作等 不足： 降低灵敏度（针对新方法其易受到杂质干扰) 、动态范 围比较窄（3数量级）、步骤繁琐( 清洗步骤多) 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned

19、herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 我们熟悉的荧光现象 荧光显微镜观察标记荧光染料分子的细胞 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光检测技术特点和原理 荧光 检测特 点 应用 领域广泛 、可多标 记检

20、测、 灵敏度高 荧 光检测原 理 Light light detector 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光技术分类 荧光强度 FI 荧光共振能量转移 FRET 时间分辨荧光 TRF 时间分辨荧光共振能量转移 TR-FRET 荧光偏振 FP 2012 For research use only. Not

21、for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 酶标仪如何进行荧光强度检测M系 列为例 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respectiv

22、e owners. 斯 托克位移（Stokes shift ） 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光染料分子具有不同斯托克位 移 Fluorescein Coumarin Resorufin Cascade yellow dye Stokes shifts的范围从20nm到超过150nm不等 2012 For

23、 research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光强度检测常见应用 生物大分子定量（DNA/RNA 或 蛋白质） 免疫荧光（荧光标记物，如GFP 、YFP 、CFP等） 细胞学分析（细胞增殖/ 细胞毒理/ 细胞 迁移/ 细胞 吸附/ 细胞渗透） 线粒体膜电位分析 钙 流检测 2012 For research use only. Not

24、for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 饱和荧光染料可以嵌入核酸碱基小沟中，使用特定波长的光激发该染料，检测染 料的发射光，光强度与核酸的浓度在一定范围内成线性关系 检测原理： 荧光法进行DNA定量 ds-DNA PicoGreen Ex Em 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Tr

25、ademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光强度检测灵敏度和动态范围 上的优 势 如DNA 含量检测理论可达到300pg级 21/02/2014 2011 Molecular 28 吸 收 光法（OD260 ） 荧光法 操作方法 简单，无需 标 准曲线 需做标准曲 线 灵敏度 低 高 纯度要求 核酸纯度要 求 高 核酸纯度要 求 不高 RNA定量 不稳定 稳定 干扰因素 多 少 线性范围 窄( 3 Log) 宽( 6 Log) 2012 For re

26、search use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. MultiTox-Flour 细胞活力 检测 方法（Paradigm 优势 ） Paradigm 双光源卡 盒 细胞毒制剂处理 加入底物 同时检测活细胞和死细胞的 数量 细胞数数据归一化（可比性） 减少假阳性和假阴性数据 每个孔中能够得到更多数据 （叠加其它试剂盒） 减少了测量变异 加样+混合+检测

27、（均相实验） 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 报告基因检测- 荧光是一种编码可被 检 测的蛋白质或酶的基因， 把 它的编码序列和基因表达调节 序列 相融合形成嵌合基因，或与其它 目的 基因相融合，在调控序列控制下 进行 表达，从而利用它的表达产物来 标定 目的基因的表达调控，筛选得到 转化 体 报告基因 目的

28、基因 融合表达蛋白 光 光信号的多少可以代表目的基因表达的情况 报告基因检测 报告基因检测-荧光 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 报告基因检测-荧光 实验步骤： 构建载体 转染入细胞内 融合表达蛋白（细胞内表达） 流式细胞仪 荧光分光光度计 荧光显微镜 2012 For research use only.

29、Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光法进行钙流检测意义 胞内钙离子是信息传递的第二信使 介导大量的细胞内生物学反应，如激活一系列的蛋白激酶、 蛋白酶、磷酸化酶和核酶等。 对细胞生长分化起着重要作用 参与神经递质合成与释放、激素合成与分泌 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures

30、. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 采 用 一 些可与钙离子结合的荧光物质，如下两类： 当钙离子存在时，荧光强度增加。 Calcium 3 Assay Kit 、Calcium 4 Assay Kit 、Calcium6Assay Kit 、 Calcium 6 Assay Kit （全新） 钙离子检测原理和方法 F F F F F F F F + CA+ CA+ Injection CA+ CA+ Flex3表现 出的优势 2012 F

31、or research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光强度检测优势和影响因素 荧光检测技术优势 灵敏度高、特异性好、特性参数多、动态范围宽、无 辐射等 荧光检测技术影响因素 溶液pH值、温度 、淬灭、自发荧光 、光漂白等 2012 For research use only. Not for use in diagnostic proce

32、dures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光技术分类 荧光强度 FI 荧光共振能量转移 FRET 时间分辨荧光 TRF 时间分辨荧光共振能量转移 TR-FRET 荧光偏振 FP 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices,

33、LLC or their respective owners. 荧光共振能量转移（FRET ） Frster 共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer ） 原理：使用两种发射光光谱有重叠和能相互吸收的染料, 所以 当这两种染料分子靠的很近的时候（1-10nm ）, 能量通过 FRET 的机制，会从供体染料分子上传递到受体染料分子上 21/02/2014 36 适合检测活体中生物 大分子纳米级距离和 纳米级距离变化， 生物大分子相互作用 分析、细胞生理研究、 免疫分析等领域 2012 For research use only. Not for

34、use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 免疫学分析蛋白之间相互作用 研究 21/02/2014 37 FRET 常用荧光探针选择：传统有机荧光染料、荧光 蛋白、镧系元素 应用： 可以用来监测 蛋白- 蛋白, 蛋白- 抗体, 蛋白质与DNA ，蛋白 构象改变等，核酸杂交技术与 FRET 相结合 , 可用于突变检测、 同源性分析和核酸定量分析等方面 例如：蛋白之间相互作用和蛋白质折叠 201

35、2 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 局部环境的变化会引起荧光基团发射特性的改变，也可在单分子水平进行检测 通道病是目前研究领域中重要问题之一（如Alzheimer ）， 电测量与FRET 技术 的结合可以揭示了离子通道的作用模型 单分子水平研究离子通道 38 反应通道蛋白质 构象动力学的变 化，同时指示计 能检测离子流

36、的 变化情况 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光共振能量转移的优势和影响 因素 FRET 技 术优 势 均相免洗实验、应用领域比较广 FRET影响因素 分子间有效距离受限、非特异信号干扰、不易检测 较低信号水平 21/02/2014 39 2012 For research use only. Not fo

37、r use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光技术分类 荧光强度 FI 荧光共振能量转移 FRET 时间分辨荧光 TRF 时间分辨荧光共振能量转移 TR-FRET 荧光偏振 FP 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are proper

38、ty of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 时间分辨荧光（TRF ） 21/02/2014 2011 Molecular 41 TRF (时间分辨荧光) 传统荧光染料最大弊端：荧光寿 命短，易 受到自 发荧光干 扰 染料是一种镧系元素，有着长 荧光寿 命周期 (100 sec 可 至2ms) 当被闪烁氙灯激发后, 其发射光维持的时间要比 正常的 荧光素 长很多（ns ） Stokes shift 变大，消除 激发光 和散射光的干扰 2012 For research use only. Not for use in diag

39、nostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. TRF技术-镧系元素 21/02/2014 2011 Molecular 42 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their resp

40、ective owners. 原理演示 21/02/2014 2011 Molecular 43 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 结果对比 及 优势 21/02/2014 2011 Molecular 44 2012 For research use only. Not for use in diagnost

41、ic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 时间分辨荧光的特点和应用 21/02/2014 2011 Molecular 45 时 间分辨 荧光 的特点 低 背景 在 有干扰 信号 的情况 下也 能工作 良好 ： 散 射光 短 寿命背 景荧 光 细 胞裂解 液分 析 ( 高 背景 荧光样 本) 用途 药筛 新 生儿筛 查 2012 For research use only. Not for use in diagnos

42、tic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光技术分类 荧光强度 FI 荧光共振能量转移 FRET 时间分辨荧光 TRF 时间分辨荧光共振能量转移 TR-FRET 荧光偏振 FP 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular

43、Devices, LLC or their respective owners. TR-FRET 测定的原理 TR-FRET 结合了 TRF 和 FRET 的 特点 通过能量转移可监测分子结合情况 供体荧光团是镧系元素，发光时间长，供体激发受体，受体发光时间也会比较长 TRF 低背景 FRET 均项实验 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respe

44、ctive owners. TR-FRET广泛应用于药筛领域 均相 mix and read 对于高通量筛选(HTS)非常容易 无放射性 没有危险试剂，危险试剂常需要高昂的处理费 用 采用发光期长的镧系元素 作为供 体荧光基团（比如Eu和Tb ） 避免了FI 所可能发生的背景干扰 比值测量 减小了孔与孔之间的可变性 不受培养基和混合物的干扰 可小型化 适合高通量筛选(HTS)，节约费用 可用于 GPCR、激酶及其他方法 通用实验平台 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks ment

45、ioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光检测方法在药物筛选中的应 用 49 生产商 品牌名称 使用技术 作用靶点 Perkin Elmer LANCE TR-FRET GPCR-cAMP Delfia TRF GPCR-cAMP AlphaScreen AlphaScreen GPCR-cAMP FP2 Polarization GPCR-cAMP Invitrogen LanthaScreen TR-FRET Peptides ZLyte FRET Kinases Ge

46、nBLAzer FRET Kinases Omnia Fluorescence Kinases VSP FRET Ion Channels Cisbio HTRF TR-FRET GPCR-cAMP MD IMAP TR-FRET Kinases 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. HTRF 即均相时间分辨荧光（

47、Homogeneous Time-Resolved Fluorescence） HTRF 是Cisbio 公司的注册商标，它是铕镶嵌在一个穴状化合 物结合的TR-FRET 实验平台. Cisbio 会提供HTRF 认证给那些性能符合要求的读板机 （MD 公司的M5e 、Flexstation3 、Paradigm 、I3专用卡盒 ） TR-FRET 与 HTRF 50 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Mole

48、cular Devices, LLC or their respective owners. HTRF技术上突破 HTRF 技术和TR-FRET 技术上的不同 1 ：供体染料分子Eu为穴状化合 物、其 他厂家 为螯合 物，优 势？ 穴状化合 物特 点 背景信号 低，很 少出现假 阴性和 假阳性结果 检测时间 灵活（ 可达7天） 可进行动 力学研 究（穴状 化合物 不具有光 漂白作 用） 增加了稳定性(可耐受低pH 值、金属离 子、DMSO 、EDTA 等） 专利的比值测量能矫正淬 灭和样 品带来 的干扰 21/02/2014 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光技术分类 荧光强度 FI 荧光共振能量转移 FRET 时间分辨荧光 TRF 时间分辨荧光共振能量转移 TR-FRET 荧光偏振 FP 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trad