1、DGGE 操作指南第一部分：操作前准备试剂准备1. 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺储存液250xTAE 缓冲液高压灭菌 20-30min3.变性剂脱气 10-15min，过 0.45 膜。4棕色瓶中保存。100%变性剂储存后需温浴重溶解。4. 稀释梯度5. 10%过硫酸铵6. 2x 染色剂2%溴酚蓝，2%二甲苯蓝，100%甘油7. 1x TAE 缓冲液试剂（？）去离子水（Millpore 纯化柱）丙烯酰胺，双丙烯酰胺尿素TrisEDTA乙酸甲酰胺TEMED （tetramethylethylenediamine，四甲基乙二胺）过硫酸铵Triton硝酸银100%乙醇NaOH甲醛溴酚蓝二甲苯蓝甘油。第
2、二部分：DGGE 操作步骤1. 将海绵垫固定在制胶架上，把类似三明治结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。2. 共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在 30ml 的注射器上。3. 在两个注射器上分别标记高浓度与低浓度，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。4. 反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cm
3、gels(1mm thick) ：设体积调整装置到 14.5。5. 配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。6. 每管加入18 l TEMED，80 l 10%APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有高浓度的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上。7. 通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够。8. 分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确! 再将注射器的聚丙烯管同Y 形管相连。9. 轻柔并稳定地旋转凸轮
4、来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中。10. 小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。并把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60。11. 迅速清洗用完的设备。12. 聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，清洗点样孔，盖上温度控制装置使温度上升到60。（以上为制胶过程）13. 用注射针点样（预先准备好的16S rDNA V3 区 PCR 扩增产物，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化）。14. 电泳（200V，5h）。15. 电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。用去离子水冲洗，使胶和玻璃板脱离。16. 倒掉去离子水，加入25
5、0 ml 固定液（10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸）中，放置15min。17. 倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入250 ml 银染液（0.2% AgNO3, 用之前加入200l 甲醛）中，放置在摇床上摇荡，染色15min。18. 倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入250 ml 显色液（1.5% NaOH, 0.5% 甲醛）显色。19. 待条带出现后拍照。TGGE 操作步骤1. 去离子水仔细洗涤制胶所用玻璃板，用纸巾擦干。再用酒精棉球擦一遍，用纸巾擦干。将支持膜夹在两块玻璃板之间，用夹子夹住，放置在桌上。2. 配胶 (每块胶配5ml)胶的组成 储存溶液 5ml胶丙烯酰胺(8%)
6、 40% (37.5:1)尿素(8M) 2.4gTAE 50 0.1ml甲酰胺(20%) 100% 1mlddH2O 1.22mlTEMED 7l过硫酸胺 10% 233. 将玻璃板倾斜放置，用1ml 的移液器将上面配置的胶慢慢灌入两玻璃板之间。将玻璃板水平放置半小时以上，使胶凝固。4. 待胶凝固后，先用手拨去没有点样孔的玻璃板。用去离子水将支持膜背面冲洗干净，用纸擦干。再揭开支持膜。5. 用1ml 移液器在TGGE 的温度面板（如图, thermoblock）上加800 l 0.1% Triton。TGGE铺膜示意图6. 用手抓住支持膜的两边，先将膜中部放于加热面板上，再慢慢将膜铺展开，在膜
7、和加热面板间尽量不要形成气泡。温度梯度方向和电泳方向一致。7. 将预先准备好的样品加入上样孔中，每孔最多加3 l 样品。8. 在胶的两端盖上Waterman 滤纸（图，buffer wick），滤纸的另一端浸入电泳缓冲液中。9. 盖上盖子，预电泳（200V，7min）。10. 预电泳快结束时（6min 50sec），暂停反应。打开盖子，揭开滤纸。在凝胶中间慢慢盖上一层塑料膜（图6，cover film）。再将滤纸盖在胶上，然后用一块玻璃板（图6，coverplate with sealings）压在滤纸上。11. 盖上盖子，继续电泳（200V，3h）。12. 电泳结束后，终止程序。将支持膜取出
8、，先用去离子水冲洗一次。13. 将膜转移至固定液（10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸）中，放置5min。14. 将膜转移至去离子水中冲洗一次，再转移至银染液（0.2% AgNO3, 用之前加入40l 甲醛）中，放置在摇床上摇荡，染色10min。15. 将膜在去离子水中冲洗2 次，转移至显色液（1.5% NaOH, 0.5% 甲醛）中。16. 待条带出现后，将膜用去离子水冲洗 3 次，拍照。注意事项DGGE1 配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。2 制胶是实验的关键。在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。3 灌完胶后
9、，立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。4 DGGE 的电泳缓冲液要超过“RUN”刻度线，不要超过“Maximam”刻度线。5 点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样。6 银染的整个过程中，一定要戴手套。以避免手接触胶而带来的污染。7 每次用完仪器后要及时清理，清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。TGGE1. 配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。2. 保护层（protection foil）用来保护温度面板（gradient block），要防止试剂浸入，每次用完后要把残余的试剂吸干。一旦破损，应停止使用，更换后再继续使用。3 TGGE mini system T1T2 之间的温度差不能超过 45。4 支持膜和温度面板间一定要加 0.1% Triton，从而确保能形成稳定的温度梯度。
