环境微生物实验指导书2010.5.25(修改).doc

1、- 1 -环境微生物学实验指导龙建友 崔明超 夏建荣 编广州大学环境科学与工程学院二零壹零年四月- 2 -实 验 室 守 则为了维持环境工程微生物实验室的工作秩序，保证环境工程微生物学实验的教学质量，特制定本守则。1. 进入环境生物学实验室的学生必须严格遵守实验室的各项规章制度。2. 认真预习环境微生物学实验指导 ，明确每次实验的目的、要求、原理和方法，做到心中有数。3. 仔细观摩实验指导老师的讲解和示范，了解仪器设备的基本技能，掌握实验操作的基本 要领，严格按照规程操作。4. 珍惜每次实验机会，重视各项试验技能，认真观察实验现象，如实做好实验记录。5. 需集中处理的物品，应注明组别、名称及处

2、理方法，放在教师指定的地方。6. 实验结束后，做好仪器设备、试剂药品等整理工作，经教师验收后，将仪器设备放回原处。值日学生做好实验室的清洁卫生工作。7. 提倡科学严谨的实验作风。仔细整理实验结果，认真完成实验报告，并将报告按时交给指导老师披阅。8. 爱护国家财产。如因违规操作而损坏仪器设备，须按学校有关规定赔偿。9. 保持实验室安静，维护实验室整洁。- 3 -目录实验一 光学显微镜的使用实验二 培养基的制备与灭菌实验三 空气微生物的检测实验四 水中细菌总数的测定实验五 土壤微生物的计数法实验六 微生物的染色实验七 水中总大肠菌群的测定实验八 环境样品蛋白质含量的测定实验九 重金属污染物对光合作

3、用强度影响的测定实验十 叶绿素 a 的测定实验十一 聚合酶链反应- 4 -实验 1 通光学显微镜的使用普通光学显微镜简称光学显微镜（light microscope） ，以平均波长为 550nm 的可见光作为光源，能分辨的两点距离为 0.22。多数细菌的个体大于 0.25m，因此可在光学显微镜下观察。由于许多细菌的大小与光学显微镜的分辨率处于同一个数量级，为了看清细菌的形态与结构，经常使用油镜来提高显微镜的分辨率。在光学显微镜的使用中，油镜的使用是一项十分重要的操作技术。一、目的要求1了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。2学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。3在油镜下

4、观察细菌的几种基本形态。4采用悬滴法在高倍镜下观察细菌运动。二、基本原理（一）普通光学显微镜的构造普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图 1-1） 。1机械系统机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。（1）镜座：它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。（2）镜臂：用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。（3）镜筒：它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。镜筒长度一般固定，通常是 160mm。有些显微镜的镜筒长度可以调节。（4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有 35 个

5、不同放大倍数的物镜。为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜。转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。（5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；装有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后和左右移动。有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。- 5 -（6）调节器：调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。粗调旋转动一圈可使镜筒升降约 10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约 0.1mm。2光学系统光学系统包括

6、目镜、物镜、聚光器、反光镜等。（1）目镜：它的功能是把物镜放大的物像再次放大。目镜一般由两块透镜组成。上面一块称接目透镜，下面一块称场镜。在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。由于光阑的大小决定着视野的大小，故又称它为视野光阑。标本成像于光阑限定的范围之央光阑上粘上一小段细发可用作指针，指示视野标本的位置。在进行显微测量时，目镜测微尺被安装在视野光阑上。目镜上刻有 5、10、15 、20等放大倍数。可按需选用。（2）物镜：它的功能是民标本放大，产生物像。物镜可分为低倍镜（4或 10） 、中倍镜（20） 、高倍镜（4060）和油镜（100） 。一般油镜上刻有 “OI”（oil immersion）

7、或 HI（ homogeneous immersion）字样，有的刻有一圈红线或黑线，以示区别。物镜上通常标有放大倍数、数值孔径（numerical aperture，简称 NA） 、工作距离（物镜下端至盖玻片间的距离，mm）及盖玻片厚度等参数。以油镜为例，100/1.25 表示放大倍数为 100 倍，NA 为 1.25；160/0.17 表示镜筒长度 160mm，盖玻片厚度等于或小于 0.17mm。（3）聚光器：聚光器又称聚光镜，它的功能是把平行的光线聚焦于标本上，增强照明度。聚光器安装在镜台下，可上下移动。使用低倍物镜（简称低倍物镜）时应降低聚光器，使用油镜时则应升高聚光器。聚光器上附有虹

8、彩光阑（俗称光圈） ，通过调整光阑孔径的大小，可以调节进入物镜光线的强弱（物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系见图。在观察透明标本时，光圈宜调得相对小一些，这样虽会降低分辨力，但可增强反应，便于看清标本。（4）反光镜：它是普通光学显微镜的取光设备，其功能是采集光线，并将光线射向聚光器。反光镜安装在聚光器下方的镜座上，可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。反光镜的一面是凹面镜，另一面是平面镜。一般情况下选用平面镜，光量不足时可换用凹面镜。（二）普通光学显微镜的性能。1数值孔径数值孔径（NA）又称开口率，是指介质折射率与镜口角 1/2 正弦的乘积，可用式 1-1表示。 2sinNA式中 1-1 中

9、，n 为物镜与标本之间介质的折射率， 为镜口角（通过标本的光线延伸到物镜边缘所形成的夹角。物镜的性能与物镜的数值孔径密切相关，数值孔越大，物镜的性能越好。因为镜口角 总是小于 180，所以 的最大值不可能超过 1。又因为空气的折射率为 1，所以以空2si气为介质的数值孔径不可能大于 1，一般为 0.050.95。根据式 1-1，要提高数值孔径，一个有效途径就是提高物镜与标本之间介质的折射率。使用香柏油（折射率为 1.515）浸没物镜（即油镜）理论上可将数值孔径提高至 1.5 左右；实际数值孔径值也可达 1.21.4。2分辨率分辨率是指分辨物像细微结构的能力。分辨率常用可分辨出的物像两点点的最小

10、距离（D）表征（式 1-2） 。D 值愈小，分辨率愈高。- 6 -2sinD式 1-2 中， 为光波波长。比较式 1-1 和式 1-2 可知，D 可表示为： NA根据式 1-3，在物镜数值孔径不变的条件下， D 值的大小与光波波长成正比。要提高物镜的分辨率，可通过两条途径：采用短波光源。普通光学显微镜所用的照明光源为可见光，其波长范围为 400700nm。缩短照明光源的波长可以降低 D 值，提高物镜分辨率。加大物镜数值孔径。提高镜口角 或提高介质折射率 n，都能提高物镜分辨率。若用可光作为光源（平均波长为 550nm） ，并用数值孔径为 1.25 的油镜来观察标本，能分辩出的两点距离约为 0.

11、22m。3放大率普通光学显微镜利用物镜和目镜两组透镜来放大成像，故又被称为复式显微镜。采用普通光学显微镜观察标本时，标本先被物镜第一次放大，再被目镜第二次放大。所谓放大率是指放大物像与原物体的大小之比。因此，显微镜的放大率（V）是物镜放大倍数（V 1）和目镜放大倍数（V 2）的乘积，即：V=V1V2 （1-4）如果物镜放大 40 倍，目镜放大 10 倍，则显微镜的放大率是 400 倍。常见物镜（油镜）的最高放大倍数为 100 倍，目镜的最高放大倍数为 15 倍，因此一般显微镜的最高放大率是1500 倍。4焦深一般将焦点所处的像面称为焦平面。在显微镜下观察标本时，焦平面上的物像比较清晰，但除了能

12、看见焦平面上的物像外，还能看见焦平面上面和下面的物像，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深与数值孔径和放大率成反比，数值孔径和放大率越大，焦深越小。因此，在使用油镜时需要细心调节，否则物像极易从视野中滑过而不能找到。三、实验器材1菌种：培养 1218h 的枯草杆菌（Bacillus subtilis）斜面培养物 34 支。2标本片：细菌三种基本形态的染色标本，特殊形态细菌染色标本（示范镜） 。3仪器及相关用品：显微镜，香柏油，二甲苯（或 1：1 的乙醚酒精溶液） ，擦镜纸。4其他用品：盖玻片，凹玻片，吸水纸，酒精灯，接种环，牙签，凡士林。四、实验程序（一）显微镜（油镜）操作1领取并检查显微镜

13、：按学号向实验指导老师领取显微镜，所有实验课均对号使用。从显微镜箱中取出显微镜时，用右手紧握镜臂，左手托住镜座，直立平移，轻轻放置在实验台上。检查各部件是否齐全，镜头是否清洁。若发现有问题应及时报告老师。2调节光源：良好的照明明保证显微镜使用效果的重要条件。将低倍镜旋转到工作位置，用粗调螺旋提升镜筒，使镜头距离载物台 10mm 左右，降低聚光镜的位置，完全打开虹彩光阑，一边看目镜，一边调节反光镜镜面的角度（在正常情况下，一般用平面反光镜；若自然光线较弱，则可用凹面反光镜） 。然而，调节聚光器的位置（酌予升降） ，直至视野内得到均匀适宜的亮度。3低倍镜观察：使用低倍观察，视野较广，焦深较大，便于

14、搜寻目标，因此宜从低倍镜开始观察。将载玻片标本（涂面朝上）置于载物台中央，用压片夹固定，并将标本部位- 7 -移到正中，转动粗调螺旋，使镜头与标本的距离降到 10mm 左右。然后，一边看目镜内的视野，一边调节粗调螺旋缓慢升高镜头，至视野内出现物像时，改用细调螺旋，继续调节焦距和照明，以获得清晰的物像，并将所需部位移到视野中央，再换中、高倍镜观察。4中、高倍镜观察：依次用中、高倍镜观察低倍镜下锁定的部位，并随着物镜放大倍数的增加，逐步提升至最高点，转动转换器，移开高倍镜，使高倍镜和油镜成“八”字形，在标本中央滴一小滴香柏油，把油镜镜头浸入香柏油中，微微转动细调螺旋，直至看清物像。如果油镜上升至离

15、开油面还未看清物像，则需重新调节。可从侧面注视，小心地转动粗调节器将油镜重新浸在香柏油中，但不能让油镜压在标本上，更不能用力过猛，以免击碎玻片，损坏镜头。6调换标本：观察新标本片时，必须重新从第 3 步开始操作。7用后复原：观察完毕，转动粗调螺旋提升镜筒，取下载玻片，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸取少许二甲或 1：1 的乙醚酒精溶液（香柏油可溶于二甲苯及1：1 的乙醚酒精溶液） ，擦去镜头上的残留油迹，再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯（或 1：1 的乙醚酒精溶液） ，最后用细软的绸布擦去机械部件上的灰尘和冷凝水。降低镜筒，将物镜转成“ 八” 字形置于载物台上。降低聚光器，避免聚光

16、器与物镜相碰。使反光镜垂直于镜座，以防受损。将显微镜放回显微镜箱中锁好，并放收指定的显微镜柜内。（二）细菌形态观察1结合显微镜（油镜）的使用，观察三个细菌染色片（球菌、杆菌、和螺旋菌。2看示范镜，观察双球菌和四联球菌，并绘图。（三）细菌运动性观察有些细菌具有鞭毛，能在水中自由运动。细菌运动常用水浸片法和悬滴法观察。1水浸片法用接种环取培养 1218h 的枯草杆菌菌液一环，置于干净的载玻片中央，盖上盖玻片（图 1-16，注意不使产生气泡） ，用低倍镜找出目标后，再换用中倍至高倍镜观察。2悬滴法取一洁净的盖玻片，用牙签挑取少量凡士林，涂于盖玻片四有；再按无菌操作要求，用接种环从斜面底部取培养 12

17、18h 的枯草杆菌菌液一环，置盖玻片中央（菌液呈水珠状） ；接着取凹玻片一块，将凹窝向下覆盖在带有菌液的盖玻片上；翻转凹玻片，使液滴悬于盖玻片表面。悬滴片制成后，先用低倍镜找到水滴，再换高倍镜观察，可以看到活跃的细菌运动。五、注意事项1不要擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏设备。2拭擦镜面请用擦镜纸，不要用手指或粗布，以保持镜面的光洁度。3观察标本时，请依次用低倍、中倍、高倍镜，最后再用油镜。在使用高倍镜和油镜时，请不要转动粗调螺旋降低镜筒，以免物镜与载玻片碰撞而压碎玻片或损伤镜头。4观察标本时，请两眼睁工，一方面养成两眼轮换观察的习惯，以减轻眼睛疲劳，另一方面养成左眼观察、右眼注视绘衅的习惯

18、，以提高效率。5取显微镜时，请用右手紧握镜臂，左手托住镜座，切不可单手拎镜臂，更不可倾斜拎镜臂。6沾有有机物的镜片会滋生霉菌，请在每次使用后，用擦镜纸擦净所有的目镜和物镜，并将显微镜存放在阴凉干燥处。- 8 -实验 2 培养基的制备与灭菌一、目的要求学习和掌握营养琼脂培养基、查氏培养基和高氏一号培养基的配制方法。二、基本原理营养琼脂培养基是一种广泛用于细菌的培养基，主要成分是牛肉膏、蛋白胨和 NaCl。它们主要提供细菌生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子等。查氏培养基是一种广泛用于霉菌的培养基，在配制过程中，不经 pH 调节而呈自然状态。高氏一号培养基是一种用于放线菌的合成培养基，

19、以可溶性淀粉作为碳源和能源，硝酸钾作为氮源，磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁作为无机盐。三、实验器材1药品和试剂：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，马铃薯，蔗糖，可溶性淀粉，K2HPO4，KNO 3，MgSO 47H2O，FeSO 47H2O，1mol/L HCl 和 1mol/L NaOH 等。2仪器：天平，电炉，pH 计。3玻离器皿：移液管，烧杯，量筒，锥形瓶，培养皿，玻璃漏斗，玻棒，带有棉塞的无菌试管，带铝盖的试管等。4其他物品：刻度搪瓷杯，药匙，称量纸，pH 精密试纸，记号笔，纱布，线绳，牛皮纸，报纸，标签等。四、实验程序（一）营养琼脂培养基的配制营养琼脂培养基的配方见下表，配制步骤如下。1材

20、料用量的计算 根据配方以及所需配制培养基的数量，称取或量取所需的材料，在本实验中，先将配方中的各种材料配成浓缩液：10%牛肉膏、10% 蛋白胨、10%氯化钠。如果需要配制 300mL 培养基，则吸取 10%牛肉膏 15mL，10%蛋白胨 30mL，10%氯化钠15mL，称取琼脂 6g。表 1 营养琼脂琼脂培养成分组分 含量（每 1000mL 培养基） 灭菌条件牛肉浸膏蛋白胨氯化钠琼脂自来水pH5g10g5g20g1000mL7.27.41.21kg/cm220min2配制 将吸取的材料加入有刻度的搪瓷烧杯，用自来水补足 300mL，并记下刻度。在电炉上加热溶解，并用玻棒搅匀。3调节 pH 按照

21、要求，将 pH 调节至 7.4。从电炉上取下搪瓷杯，用玻棒蘸取少量培养液至 pH 试纸上，与比色卡对照得出 pH 值。根据偏差大小，分别滴入浓度 1mol/L HCl或 NaOH 溶液进行调节，并不断用 pH 试纸检测 pH 值，直至达到预期的 pH 值。4加入琼脂 在液体培养基中加入称好的琼脂 6g，加热至沸腾，期间不断用玻璃搅拌，以防糊底，直至琼脂完全熔化。最后补足蒸发损失的水分。5分装培养基 培养基的分装应当趁热在漏斗架上完成。在带有棉塞的无菌试管中，每支分装 5mL，共 10 支，用于制作斜需。带有铝盖的试管各装 10mL，共 20 支，用于制- 9 -作平板。6包扎成捆 以 10 支

22、为一捆，用防水纸包扎成捆，挂上标签，灭菌备用。（二）查氏培养基的配制查氏培养基培养基的配方见表 2，如需配制 1000mL 培养基，操作步骤如下。表 2 查氏培养基成分组 分 含量（每 1000mL） 灭菌条件硝 酸 钠 蔗糖（或葡萄糖）磷 酸 氢 二 钾 自来水琼脂pH3g 30g1g1000mL20g自然1.21kg/cm220min（三）高氏一号培养基的配制高氏一号培养基的配方见表 3，如需配制 1000mL 培养基，操作步骤如下：表 3 高氏一号培养基配方组 分 含量（每 1000mL 培养基） 灭菌条件可溶性淀粉KNO3K2HPO4MgSO47H2ONaClFeSO47H2O琼脂自来

23、水pH20.0g1.0g0.5g0.5g0.5g0.01g20g1000mL7.27.41.21kg/cm220min1计算称量 吸取 1% KNO3 30mL；1% K 2HPO4 15mL；1% MgSO47H2O 15mL；1% NaCl 15mL；1% FeSO47H2O 0.3mL，置电炉上加热。2淀粉预处理 用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉 6g，从 300mL 水中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待前一只搪瓷杯内的培养液沸腾后，将淀粉糊洗入培养液中，搅匀。3调节 pH 从电炉上取下搪瓷杯，按照配制细菌培养基的方法，用 NaOH 或 HCl 将pH 调节至 7.4.4加入琼脂 加入

24、琼脂 6g，在加热的同时，不断用玻棒搅拌，要求将底部的淀粉糊搅起来，以防糊底。加热至琼脂完全熔化。5分装培养基 趁热分装培养基，取 10 支无菌棉塞试管，各分装 5mL，另取 20 支铝盖无菌试管，各分装 10mL。后续步骤同细菌培养基的配制。五、注意事项1由于配制培养基所需的材料较多，称取材料后，最好根据配方核对一遍，以免搞错。2在配制培养基的过程中，各材料按照配方所列次序添加。所用容器的大小应为培养配制量的两倍，以便操作。3熔化琼脂时，要控制火力，并不断搅拌，以免琼脂烧焦和外溢。4用于分装培养基的容器应当洁净并经灭菌。分装培养基的动作要快，以防培养基凝- 10 -固。如果分装量难以控制，可

25、用装好等体积自来水的同规格试管作为参照。切勿让培养基沾污试管口，以免招致杂菌污染。实验 3 空气微生物检测一、目的要求l学习空气中微生物数测定的方法。2了解一定环境空气中微生物的分布情况，学习并掌握检定空气微生物基本方法。二、器材l培养基 营养琼脂培养基、高氏合成一号培养基、查氏培养基、无菌水。2.仪器或其他用具 灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。空气中微生物的数量及种类常因污染源及污染程度不同而异。空气污染物多以气溶胶形式存在，微生物气溶胶也可以污染食品或水源。人类很多疾病从空气直接传染，经空气传播的病原菌主要有结核杆菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、溶血性链球菌、金黄

26、色葡萄球菌、脑膜炎球菌、感冒病毒、麻疹病毒等。因此，空气中微生物污染情况的检验，目前在许多行业中倍受重视，一般以细菌和真菌作为检测目标。空气中细菌的检验方法较多，在此介绍一种常见而简单的方法。沉降法将盛有培养基的平板放在空气中暴露一定时间，经培养后计算出其上所生长的菌落数。此法简单，使用普遍，由于只有一定大小的颗粒在一定时间才能降到培养基上，因此，所测得微生物数量欠准确，检验结果比实际存在数量少，并且也无法测定空气量，所以，仅能粗略计算空气污染程度及了解被测区微生物的种类。具体步骤如下：1、 将已制备好的营养琼脂、查氏培养基和高氏合成一号培养基三种平板置于检测地点，打开平板盖在空气中暴露 5-

27、10min；2、 盖上培养皿盖，置于 37培养 24-48h，根据平板上所生长的菌落数计算出1m3 或者 1L 空气中的细菌总数；3、 计算，奥梅梁斯基认为：在面积为 100cm3 平板琼脂培养基表面上，5min 降落的细菌数经 37培养 24h 所生长的菌落数和 10L 空气中所含的细菌数相当。根据奥氏公式计算X= N100100r 2在公示中，X 表示每 1m3 空气的细菌个数，N 表示 5min 降落在平板上，经 37培养24h 后所生长的菌落数，r 表示平板的半径，记录空气中微生物的种类和相对数量，并将结果填入下表中。- 11 -实验 4 水中细菌总数的测定一、目的要求l学习水样的采取

28、方法和水样细菌总数测定的方法。2了解水质状况与细菌数量在饮水中的重要性。二、基本原理本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。三、器材l培养基 营养琼脂培养基，无菌水。2.仪器或其他用具 灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。四、操作步骤l水样的采取(1)自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼 3min 灭菌，再开放水龙头使水流

29、 5min 后，以灭菌三角烧瓶接取水样。(2)池水、河水或湖水 应取距水面 l015cm 的深层水样，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。2细菌总数测定(1)自来水(2)池水、河水或湖水等稀释水样 将水样稀释为 10-1、10 -2 与 10-3 浓度。三个稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在 30300 个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取 10-1、10 -2、10 -3 三个连续稀释度，污秽严重的取 10-2、10 -3 、10 -4 三个连续稀释度。3菌落计数方法(1)先计算相同稀释度的平

30、均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘 2 以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。(2)首先选择平均菌落数在 30300 之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范菌落结果 细菌 霉菌 放线菌5min室内10min15min室外10min- 12 -围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。(3)若有两个稀释度的平均菌落数均在 30300 之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于 2，应采取两者的平

31、均数；若大于 2，则取其中较小的菌落总数。(4)若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。(5)若所有稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在 30300 之间，则以最近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数。记录不同稀释度平板中细菌得数量情况，填入下表中。稀释度及菌落数两稀释度之比菌落总数/（cfu/g或cfu/mL）菌落总数/（cfu/g或cfu/mL）1 2 3 4 5 6 7 五、思考题1、从自来水细菌总数结果来看，是否合乎饮用标准？2、你所测得得水源水污秽程度如何？3、

32、国家对自来水得细菌总数有一标准，那么各地能否自行设计条件(培养温度、培养时间)来测定水样总数呢？为什么？- 13 -实验 5 土壤微生物的计数法一、目的要求学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。二、基本原理平板菌落计数法是实验室最常用的活菌计数法。在高度稀释条件下，待测样品中的微生物被分散成单个细胞，经过适当培养，每个细胞可以在固体培养基上形成单个菌落。根据对样品进行系列稀释，使其中的微生物分散成单个细胞，否则一个菌落就不只代表一个细胞。计数时，需要取适当稀释度的菌液接种于固体平板培养基上，否则会因菌落太多而无法准确计数。一般以直径 9cm 平板上出现 30300 个菌落为宜。采用本法测得的菌

33、数是培养基上生长出来的菌落数量，故被称为活菌计数法。三、实验器材1待测样品：新鲜活性污泥液。2培养基：营养琼脂培养基，查氏培养基、高氏合成一号培养基。3仪器：恒温培养箱，电炉，恒温水浴锅。4其他用品：45mL 无菌水（装在三角瓶中，并带有玻璃珠 10 粒） ，9mL 无菌水（装在试管中） ，无菌培养皿，无菌移液管，无菌三角玻璃棒，酒精灯，火柴，记号笔。四、实验程序（一）制作平板培养基将融化的培养基冷却至 5560，右手持盛培养基的三角瓶于火焰旁，用左手将瓶塞轻轻地拔出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰旁打开一条缝，倒入大约 15mL 培养基，盖好皿盖，轻轻摇动培养皿，使培养基均

34、匀分布在培养皿底部，在桌面上冷凝成平板，备用。（二）制备土样稀释液用无菌移液管吸取 5 新鲜污泥液，放入盛有 45mL 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，用手或在摇床上振荡 1020min，使污泥与水充分混匀并将细胞分散，即成 10-1 稀释液。用1mL 无菌称液管吸取 1mL 菌悬液，加至盛 9mL 无菌水的试管中，混合均匀即成 10-2 稀释液，以此类推，可制成 10-3、 10-4、10 -5、10 -6 等不同稀释度的菌悬液。（三）涂布培养稀释平板计数的操作过程如下。1取样接种：用记号笔在平板上做好标记，分别用无菌移液管吸取 0.1mL10-4、10 -5、10 -6 污泥稀释液，加至对应

35、的平板培养基中央，每个稀释度设三个重复。2涂布平板：右手拿无菌三角玻棒，左手拿加好稀释液的平板，将皿盖在火焰旁打开一条缝进行涂布。涂布时，使无菌三角玻棒沿同心圆方向轻轻地向外扩展，让稀释液均匀分布至整个平板表面。- 14 -3倒置培养：在室温静止 510min，使菌液渗入培养基。然后，将平板培养基倒置于恒温培养箱中培养 48h，平板表面长出菌落。（四）计数从 3 个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出被测样品中的含菌数。筛选适宜稀释度（即计算稀释度）的标准是：1在每个平皿中，细菌、放线菌、酵母菌的菌落数为 30300 个，霉菌的菌落数为10100 个。2同一稀释度的各个重复之间，菌落数不能相差太

36、大。3从低稀释度到高稀释度，以菌落数递减 10 倍为基础，各稀释间的递减误差越小越好。4菌悬液的含菌数可按下面公式进行计算：新鲜花污泥液含量（个/mL）=平均落数稀释倍数五、注意事项1预先制好平板，并将其放入 30恒温培养箱，去除平板上的存留水或皿盖上的冷凝水。否则，平板上的冷凝水会影响检测结果。2当平板上出现大片菌苔时，应弃除该皿的菌落数。（四）四大类微生物菌落形态的识别和比较微生物的个体形态是群体形态的基础，群体形态则是无数个体形态的集中反映，每一类微生物都有一定的菌落特征，大部分菌落都可以根据形态、大小、色泽、透明度、致密度和边缘等特征来识别。熟悉和掌握四大类微生物（即细菌、酵毒菌、放线

37、菌和霉菌）的形态特征，对于菌种的识别和筛选具有重要作用。四大类微生物菌落的基本特征见表 12-1。表 12-1 细菌、酵毒菌、放线菌和霉菌菌落的形态特征及主要区别真菌类群特征项目细菌 放线菌酵母菌 霉菌菌落表面形态特征圆形或不规则；边缘光滑或不整齐；大小不一，表面光滑或皱褶；颜色不一，常见灰白色、乳白色；湿润黏稠与细菌比较，主要区别为表面干燥，呈细致的粉末状或茸毛状颇似细菌的菌落，一般圆形，表面光滑，但不及细菌菌落湿润、黏稠；多显乳白色与细菌比较，差异显著。与放线菌比较，表面呈绒毛状或棉絮状，如呈粉末状，则不及放线菌致密菌落在培养基上生长情况整个菌落易用接种环从培养基表面刮去菌落表面的粉末或茸

38、毛（气生菌丝和孢子丝）可用接种环从培养表面刮去，但菌落基部（基质菌丝）不易用接种环刮去，留下圆形、密实的基部菌丝状与细菌相似与放线菌比较，整个霉菌菌落可用接种环从培养基表面刮去，不会在培养基上留下圆形、密实的基部菌丝块。菌落生长过程从菌落形成到成熟，主要变化为增大、增厚、颜色加深初期出现由密实的基质菌丝构成的菌落，随后菌落表面出现细与细菌相似初期出现白色或无色的绒毛状或棉絮状菌落，随后霉菌- 15 -致、绒毛或粉末状的气生菌丝和孢子丝，并呈现不同颜色形成孢子，呈现粉末状和不同颜色可能出现的气味 臭味 土腥味、冰片味 酒香味 霉味四大类微生物在个体和菌落上的主要区别是：1细胞形态细菌小而分散。酵

39、母菌大而分散。放线菌细丝状。霉菌粗丝状。2菌落形态细菌表面湿润，小而薄。酵母菌表面湿润，大而厚。放线菌表面干燥，小而致密。霉菌表面干燥，大而蓬松。- 16 -实验 6 微生物的染色细菌的基本形态主要有球状、杆状、和螺旋状。在适宜的生长条件下，细菌细胞一般在幼龄阶段呈现物定形态。但右培养条件发生变化或培养物老龄化，菌体形态会出现异常。细菌个体微小且无色透明，对光线的吸收和反射与水溶液差别不大，直接在显微镜下观察，不易看清它们的真实面目。对菌体进地染色，可以增加反差，显现细菌的一般结构和特殊结构。染色技术是微生物形态学研究的重要手段，它可分为简单染色、鉴别染色和特殊染色三种类型。一、简单染色（一）

40、目的要求1学习细菌涂片的基本技术。2掌握细菌简单染色法。3熟练掌握显微镜油镜的使用技术。（二）基本原理简单染色是采用一种染料使细菌着色的染色方法。微生物细胞含有蛋白质、核酸等两性电解质，在酸性溶液中离解出碱性基团而带正电荷，在碱性溶液中离解出酸性基团而带负电荷。细菌的等电点为。在中性（pH 7） 、碱性（pH 7）或偏酸性（pH 67）溶液中，细胞的等电点低于溶液的 pH 值，因此菌体一般带负电荷。因为电离后碱性染料带正电荷，可与菌体内的负电荷结合，所以在细菌学研究中大多采用碱性染料进行染色。常用的碱性染料有碱性复红、番红、结晶紫、孔雀绿、美蓝等。（三）实验器材1菌种：芽孢细菌2染色液：石炭酸

41、复红染色液。3仪器及相关用品：显微镜，香柏油，二甲苯（或 1：1 的乙醚酒精溶液） ，擦镜纸。4其他用品：蒸馏水，载玻片，吸水纸，酒精灯，火柴，接种环，镊子，无菌牙签。（四）实验程序简单染色的操作过程如下。1涂片：取一片洁净无油污的载玻片（通常保存于盛有酒精的广口瓶内，用镊子取出载玻片，在酒精灯上引燃载玻片表面的酒精，冷却后即可使用） ，在中央滴一小滴蒸馏水，用无菌牙签取少许牙垢，与水滴混匀，涂成薄层（直径约为 10mm） 。2干燥：让涂片自然干燥，也可将涂面朝上在酒精灯上稍稍加热，使其干燥。注意切勿离火焰太近，温度过高会破坏菌体形态（用手背接触载玻征反面，以皮肤不觉得烫为宜） 。- 17 -

42、3固定：涂片染色前必须先固定，目的是杀死细菌，使菌体粘附于载玻片上，同时增加菌体对染料的亲和力。固定时应尽量维持菌体原有形态，防止细胞膨胀或收缩。手执载玻片，涂面朝上，在酒精灯上快速通过火焰 3 次。待载玻征冷却后，再进行染色。4染色：将载玻片置于平台上，在整个涂面上滴加石炭酸复红染色液，染色 1min 左右。5水洗：染色时间一到，倾去染色液，用自来水细流冲洗涂片，直到流水中无染料颜色为止。6干燥：可轻轻甩去载玻片上的水珠，使其自然干燥；也可用吸水纸吸去载玻片上的水珠。7镜检：用低倍镜找到标本后，再用油镜观察各种牙垢细菌的形态，并绘出典型的视野图。（五）注意事项1载玻片要求清洁无油污，否则会导

43、致菌液涂布不开或镜检时把脏东西误视为菌体。2挑菌量宜少，涂片要薄而均匀，过厚菌体会导致细胞重叠而不便观察。3染色时间与细菌种类、染色液种类、染色液浓度有关，应根据具体情况做适当调整。（六）问题与思考1涂片为什么要固定？固定时应注意什么问题？2你在简单染色过程中遇到了什么问题？试分析原因。二、革兰氏染色法（一）目的要求1熟练掌握细菌涂片的基本技术。2掌握细菌革兰氏染色法。3熟练掌握显微镜油镜的使用技术，观察细菌的革兰氏反应。（二）基本原理简单染色法是采用一咱染料使细菌着色的染色方法。经简单染色后，只能观察细菌的大小、形态和细胞排列，不能鉴别细菌，也不能观察细菌的特殊结构。为此，微生物工作者创建了

44、复合染色法。复合染色法是采用两种或两种以上染料使细菌着色的染色方法。革兰氏染色法就是一种复合染色法。它于 1884 年由丹麦病理学家 Christian Gram 创建，由于这种染色方法具有鉴别细菌的功能，因此它又是一种鉴别染色法。根据革兰氏染色反应，可把细菌区别为革兰氏阳性（G +）细菌和革兰氏阴性（G -）细菌。一般认为，革兰氏染色反应与细胞壁的结构和组成有关。在革兰氏染色中，经过结晶此初洒和碘液复染，菌体内形成深紫色的“结晶紫-碘”复合物。对于革兰氏阴性细菌，这种复合物可用酒精从细胞内浸出，而对于革兰氏阳性细菌，则不易浸出。其原因是革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，脂类含量较低

45、，用酒粗脱色时，可引起细胞壁肽聚糖层脱水，网孔缩小以至关闭，阻止“结晶紫-碘”复合物外逸，从而保留初染的紫色；革兰氏阴性细菌细胞壁较薄，肽聚糖含量较少，脂类含量高，用酒精脱色时，可引起脂类物质溶解，细胞壁透性增大， “结晶紫-碘”复合物溶出，菌体呈现番红复染的红色。（三）实验器材1菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）24 小时的斜面培养物，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1216 小时的斜面培养物。- 18 -2染色液：结晶紫，碘液，番红，95%酒精，蒸馏水。3仪器及相关用品（1 套/组）：显微镜，香柏油，二甲苯（或 1：1 的乙醚酒精溶液） ，擦镜纸。4其他用

46、品：载玻片，盖玻片，吸水纸，酒精灯，火柴，接种环，镊子，特种铅笔。（四）实验程序1涂片：取一块洁净的载玻片，用特种铅笔在载玻片的左右侧，注上菌号，并在载玻片两端各滴一滴蒸馏水。将接种环在火焰上灼烧灭菌，采用无菌操作在号菌（大肠杆菌）菌苔上挑取少许菌体（不要挑起培养基） ，放在载玻片一端的水滴中，涂成均匀的薄层。接种环使用后，必须立即用火焰灼烧灭菌。再用经火焰灭菌的接种环取号菌（枯草芽孢杆菌）菌苔涂片。按照简单染色法的操作程序进行干燥固定。2初染：将涂片置于平台上，在两个涂面上滴加结晶染色液，染色 1min，然后倾去染色液，用自来水细流冲洗，至洗出液中无紫色。3媒染：先用新配的碘液冲去涂片面上的

47、残余水，或用吸水纸吸干涂片上的残余水，再用碘液覆盖涂面媒染 1min，然后水洗。4脱色：除去残余水后，滴加 95%酒精进行脱色，至载玻片上流出的酒精液中紫色接近消失为止（约 30s） ，并立即用自来水细流冲洗，终止酒精的作用。5复染：滴加番红染色液，染色 35min，水洗后用吸水纸吸干。6镜检：用低倍镜找到标本后，再用油镜观察染色后的大肠杆菌和枯草杆菌，并绘图说明染色结果。（五）注意事项1革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如果脱色过度。G +菌可被脱色而被误判为 G-菌。如果脱色时间过短，G -菌也会被误判为 G+菌。涂片厚薄以及脱色乙醇用量则会影响结果。要检验一个未知菌的革兰氏反应，应同时做一

48、张已知菌和未知菌的混合涂片，以作对照。2染色过程中，染色液应覆盖整个涂面，染色液不能过浓。水洗后轻轻甩去载玻片上的残余水珠，以免稀释染色液而影响染色效果。3要严格控制菌龄，菌体衰老时，G +菌常呈 G-反应。（六）问颧与思考1革兰氏染色中哪一步是关键?为什么?如何控制这一步？2不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌?3以固定杀死的菌体与自然死亡的菌体进行革兰氏染色有何不同?三、芽孢染色法（一）目的要求1了解细菌芽孢染色法。2观察示范镜，识别细菌细胞中的芽孢。（二）基本原理芽孢染色法是为了观察细菌芽孢而设计的一种特殊染色法。细菌芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁较厚，对染料的渗透性差，不易着

49、色。但是，一旦着色则较难脱色。根据芽孢和菌体对染料亲和力的差异，先用一种弱碱性染料孔雀绿，在加热的条件下使芽孢着- 19 -色；再用自来水冲洗，菌体中的孔雀绿易被洗掉，而芽孢中的孔雀绿难以溶出；最后用碱性石炭酸复红复染，菌体被染成红色，芽孢则呈绿色。（三）实验器材1菌种：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis） 。2染色液：孔雀绿染色液，石炭酸复红染色液，蒸馏水。3仪器及相关用品：显微镜，香柏油，二甲苯（或 1：1 的乙醚酒精溶液） ，擦镜纸，电炉。4其他用品：载玻片，盖玻片，吸水纸，酒精灯，火柴，接种环，镊子，小试管。（四）实验程序芽孢染色的操作过程如图 4-5 所示。1制备菌液：取一支小试管，加入 12 滴蒸馏水，再用接种环从斜面上挑取