1、混合淋巴细胞反应（MLR ）分别于 0h , 24h 和 48h 收集 BMDCs，与未接触过的受试菌的 native 小鼠脾脏内的 CD4+和 CD8+T 细胞进行反应，用 3H-TdR 掺入法检测其活化 T 细胞的能力。小鼠脾脏 CD4+和 CD8+细胞的制备（1） 脾脏单细胞悬液的制备：颈椎脱臼处死小鼠，自来水冲洗后浸泡在 75%酒精中 5min。无菌取脾脏放人平皿，加入 5ml 四型胶原酶溶液，用 1ml 针筒给每个脾脏注射 500ul 四型胶原酶溶液，剪碎脾脏后 37孵育 30min。将上述脾脏细胞悬液转移至 200 目不锈钢筛网，用注射器针芯研磨，过滤剩余组织。加入 6ml PBS
2、 混匀，4，1500 rpm/min ,离心 5min ，弃上清后重复一次，加入6ml PBS 重悬备用。（2） 密度梯度离心法分离脾脏单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）:吸取3ml 已预热的小鼠淋巴细胞分离液至华氏管，缓慢加入 6ml 脾脏细胞悬液，20，1800 rpm/min ,离心 25min。吸出云雾状 MNCs 层液体，加入 6ml PBS 混匀，4，1500 rpm/min ,离心 5min 。弃上清后重复一次，再加入 5ml PBS 重悬。取少量细胞适当稀释后混匀，显微镜下计数。（3） 抗体标记细胞：每 106 MNCs 加入 1ug anti-CD4
3、或 anti-CD8 单抗混匀，4孵育 10min 后加入 12 ml buffer , 4，1500 rpm/min ,离心洗涤 10min ，弃上清后重复一次。加入 90ul buffer 和 10ul streptavidin microbeads 混匀，612孵育 30min，每隔 10min 晃动均匀一次。用 12ml buffer 洗涤，4，1500 rpm/min ,离心 10min，弃上清后加入 500ul buffer。（4） 磁珠法分离 CD4+和 CD8+T 细胞：将 LS column 固定于磁珠细胞分选磁场中，加入 3ml buffer 润洗柱子。细胞悬液上株，收集阴性细胞再次上柱，3ml buffer 洗柱 3 次。将分离柱从磁场中取出，放置在合适的收集管上，加入5ml buffer，用柱塞轻柔的冲洗出细胞，再加入 5ml buffer ，快速冲洗出细胞，取少量细胞适当稀释后，显微镜下计数。调整细胞浓度为 2.5 * 106 个/ml 备用。以上操作步骤均在冰上进行。
