广谱流感疫苗的研究进展.pdf

1、生命的化学2014 年 34 卷 1 期 2 专题：新兴疫苗 收稿日期：2013-12-17 基金项目：国家卫生部重大专项(2013ZX10004003003；2013ZX10004-101-005)；中国科学院重点部署项目(KJZD-EW-L09-3) *通信作者：E-mail: 生命的化学 , 2014, 34(1): 2-12 doi: 10.13488/j.smhx.201401002 孙 兵 ， 男 ，1960 年10 月 生 ， 博 士 ， 博 士 生 导 师 。1998 年 入 选 中 科 院 “ 百 人 计 划 ” 免 疫 学 专 业 ，2003 年 获 国 家 杰 出 青

2、年 科 学 基 金 资 助 。 任 中 国 科 学 院 上 海 巴 斯 德 研 究 所 中 方 所 长 、 研 究 员 ； 中 科 院 上 海 生 命 科 学 研 究 院 上 海 生 物 化学与细胞生物学研究所研究员。 在Th1 和Th2 细 胞 的 分 化 理 论 领 域 研 究17 年 ， 在 阐 明Th1 和Th2 细 胞 分 化 理 论 与 机 制 并 深 入 理 解 这 些 细 胞 所 介 导 的 器 官 特 异 性 自 身 免 疫 病 和 哮 喘 疾 病 的 致 病 机 制 的 研 究 上 ， 取 得 了 既 有 理 论 意 义 又 有 应 用 价 值 的 系 统 性 原 创 成

3、果 ， 并 因 此 荣 获2013 年 度 国 家 自 然 科 学 二 等 奖 。 作 为 通 讯 作 者 已 发 表 了 近40 篇SCI 文 章 ， 研 究 成 果 有3 篇 发 表 在Nat Immunol ，1 篇 发 表 在Nature 上 。 承 担 多 项 国 家重大专项，“973”和“863”等重大科技研究项目。 广谱流感疫苗的研究进展 凌志洋 1 ，张 宏 2 ，边 超 1 ，孙 兵 1,2 *( 1 中国科学院上海生命科学研究所生物化学与细胞生物学研究所，上海 200031； 2 中国科学院上海巴斯德研究所，上海 200031) 摘要 ： 广 谱 流 感 疫 苗 是 指 能

4、 够 诱 导 针 对 流 感 病 毒 的 广 谱 中 和 抗 体 或 广 谱 的 细 胞 免 疫 反 应 ， 从 而 保 护 动 物 或 人 类 免 受 多 数 流 感 病 毒 毒 株 感 染 的 疫 苗 。 流 感 病 毒 广 谱 中 和 抗 体 的 发 现 及 机 制 研 究 为 广 谱 流 感 疫 苗 的 研 发 提 供 了 新 的 思 路 。 同 时 ， 流 感 病 毒 细 胞 免 疫 方 面 的 研 究 进 展 、 佐 剂 以 及 免 疫 策 略 等 的 研 究 进 展 都 极 大 促 进 了 广 谱 流 感 疫 苗 的 研 发 。 本 文 从 以 上 几 个 方 面 介 绍 广 谱

5、 流 感 疫 苗 的 研 究 进 展 ， 并 对 未 来 的应用进行评价及展望。 关键词：A型流感病毒；中和性抗体；细胞免疫；广谱疫苗 The Research perspective of Universal Influenza Vaccine LING Zhiyang 1 , ZHANG Hong 2 , BIAN Chao 1 , SUN Bing 1,2 *( 1 Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Scie

6、nces, Shanghai 200031, China; 2 Institute Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China) Abstract: The universal influenza vaccine can induce broadly neutralization antibodies or broadly cell- mediated immune responses which can protect animals and humans from the infectio

7、n of different influenza virus strains. The discovery of broadly neutralization antibodies and the research on the mechanisms provide new insights for the development of universal influenza vaccine. Moreover, the research progress on influenza virus induced cell-mediated immune responses, adjuvants

8、and immunization strategies also promote the development of universal influenza vaccine. In this review, we introduced the progress on universal influenza vaccine from above aspects and we also discussed the prospect of the application of universal influenza 凌志洋 , 等 . 广谱流感疫苗的研究进展 3 是 单 股 负 链RNA 病 毒

9、， 根 据 病 毒 抗 原 特 性 及 其 基 因 特 性 的 不 同 ， 分 为A 、B 、C 三 型 。 其 中A 型 流 感 抗 原 变 异 性 最 强 ， 宿 主 范 围 极 其 广 泛 ， 野 生 水 禽 作 为 其 天 然 储 存 库 ， 能 感 染 人 类 和 其 他 动 物 ， 较 容 易 引 起 较 大 规 模 的 流 行 。B 型 和C 型 病 毒 毒 力 较 小 ， 危 害 较 小 ， 通 常 仅 引 起 局 部 性 流 行 或 者 散 发 。A 型 流 感 病 毒 根 据 表 面 的 两 个 主 要 糖 蛋 白 血 凝 素(HA) 和 神 经 氨 酸 酶(NA) ， 进

10、 一 步 分 为16 个 血 凝 素 亚 型 和9 个 神 经 氨 酸 酶 亚 型 1 ； 最 近 从 蝙 蝠 身 上 分 离 出 第17 种HA 亚 型 和 第10 种NA 亚 型 的 流 感 病 毒 。 理 论 上 ，HA 和NA 亚 型 可 以 进 行 随 机 的 重 组 ， 这 意 味 着 可 能 存 在 一 百 多 种 的 流 感 毒 株 。 流 感 的 感 染 风 险 很 高 ， 全 世 界 每 年 有 百 万 人 感 染 ，25 万 到50 万 人 因 此 丧 命 ， 除 了 每 年 的 季 节 性 流 感 的 发 生 外 ， 偶 尔 也 会 爆 发 大 流 行 2 。 现 在

11、认 为 ， 能 够 在 人 群 中 引 起 流 行 的 流 感 病 毒 主 要 是A 型 流感病毒的H1和H3亚型以及B型流感病毒。 图1 引起人群流行的A型流感病毒 流 感 病 毒 的 抗 原 变 化 主 要 有 二 种 形 式 ， 即 抗 原 漂 变(antigen drift) 和 抗 原 转 变(antigen shift) 。 抗 原 漂 变 的 基 因 变 异 幅 度 小 或 连 续 变 异 ， 即 亚 型 内 变 异 。 一 般 认 为 这 种 变 异 是 由 病 毒 基 因 点 突 变 或 在 人 群 免 疫 力 的 选 择 压 力 下 ， 迫 使 病 毒 发 生 的 点 突

12、变 ， 主 要 引 起 小 规 模 流 行 。 当 流 感 病 毒 感 染 人 群 后 ， 针 对 病 毒 表 面 抗 原 的 抗 体 虽 然 可 以 结 合 病 毒 的 表 面 抗 原 阻 止 病 毒 感 染 人 群 但 是 这 些 抗 体 同 时 对 流 感 病 毒 施 加 了 选 择 压 力 ， 使 得 病 毒 易 产 生 逃 避 抗 体 结 合 的 突 变 ， 所 以 每 年 针 对 流 感 病 毒 都 需 要 接 种 新 的 流 感 疫 苗 ， 以 获 得 有 效 的 保 护 。 而 抗 原 转 变 的 基 因 变 异 幅 度 大 ， 通 常 是 由 至 少2 种 不 同 毒 株 进

13、 行 基 因 片 段 的 重 新 组 合 而 形 成 。 这 种 流 感 病 毒 完 整 基 因 片 段 的 重 组 形 成 新 亚 型 ( 如 H1N1 H2N2 、H2N2 H3N2) ， 由 于 人 群 缺 少 对 新 变 异 病 毒 株 的 免 疫 力 ， 从 而 引 起 流 感 大 流 行 。 历 史 上 所 记 载 的 流 感 大 流 行 都 是 由 重 组 病 毒 株 引 起 的 ， 像1918 年 的 西 班 牙 大 流 行(H1N 1) ，1957 年 的 亚 洲 流 感(H2N2) ，1968 年 的 香 港 流 感(H3N2) 以 及2009 年 的 猪 流 感(H1N1

14、) ， 均 是 由 人 流 感 病 毒 同 流 感 是 人 类 面 临 的 最 严 重 的 流 行 病 之 一 ， 是 全 球 重 点 监 测 和 造 成 死 亡 人 数 最 多 的 传 染 病 之 一 。 其 主 要 病 原 体 是 流 感 病 毒 ， 它 在 病 毒 复 制 过 程 中 和 其 自 然 进 化 中 极 易 发 生 突 变 ， 从 而 改 变 其 抗 原 性 。 据 世 界 卫 生 组 织(WHO) 预 测 ， 全 球 每 年 平 均 有1/3 的 儿 童 和1/10 的 成 人 会 感 染 流 感 。 阻 止 流 感 病 毒 在 人 群 中 传 播 的 最 有 效 手 段

15、就 是 接 种 流 感 疫 苗 。 但 是 ， 由 于 流 感 病 毒 的 宿 主 范 围 广 、 数 量 多 、 共 生 情 况 复 杂 ， 使 得 该 病 毒 在 进 化 和 传 播 过 程 中 不 断 突 变 ， 每 年 都 会 有 不 同 的 流 行 株 出 现 ， 疫 苗 需 要 每 年 进 行 更 新 ， 高 危 人 群 也 需 要 每 年 进 行 接 种 ， 而WHO 对 于 流 感 病 毒 流 行 株 的 预 测 也 并 不 是 完 全 准 确 。 因 此 ， 开 发 有 效 的 广 谱 流 感 疫 苗 是 应 对 未 来 流 感 病 毒 大 流 行 的 研 究 重 点 和 产

16、 业的一个发展方向。 1 流感疫苗的使用现状及存在的问题 流 感 病 毒 属 于 正 黏 病 毒 科(Orthomyxoviridae) ， vaccine. Key words: influenza A virus; neutralizing monoclonal antibody; cellular immunity; universal vaccine生命的化学2014 年 34 卷 1 期 4 专题：新兴疫苗 禽 流 感 病 毒 或 者 猪 流 感 病 毒 进 行 了 片 段 重 组 而 产 生的新型流感病毒造成的。 为 了 更 好 地 了 解 和 监 控 流 感 病 毒 的 流 行

17、疫 情 ， 世 界 卫 生 组 织 在 全 球 设 有 多 个 参 考 实 验 室 ， 负 责 收 集 和 整 理 当 年 在 南 北 半 球 流 行 的 流 感 病 毒 的 毒 株 数 据 ， 并 在 每 年 流 感 季 节 到 来 之 前 发 布 当 年 流 行 的 毒 株 信 息 ， 参 考 实 验 室 据 此 研 制 当 年 的 流 感 疫 苗 株 并 派 发 给 疫 苗 生 产 商 进 行 大 规 模 生 产 。 正 是 因 为 流 感 病 毒 的 多 样 性 和 多 变 性 ， 使 得 流 感 病 毒 监 测 工 作 以 及 对 流 行 病 毒 株 的 预 测 与 实 际 情 况

18、有 很 大 偏 差 。 如 果 世 界 卫 生 组 织 发 布 的 毒 株 信 息 同 当 年 的 流 行 病 毒 株 不 匹 配 ， 那 么 当 年 使 用 的 疫 苗 就 起 不 到 有 效 的 保 护 作 用 。2009 年 爆 发 甲 流 疫 情 时 ， 由 于 甲 流 病 毒 不 在 世 界 卫 生 组 织 推 荐 的 当 年 流 行 株 的 范 围 内 ， 使 得 疫 苗 生 产 在 短 期 内 无 法 提 供 有 效 的 疫 苗 ， 不 能 及 时 预 防 和 防 治 甲 流病毒的大流行。 目 前 预 防 流 感 病 毒 感 染 最 有 效 的 途 径 就 是 接 种 流 感 疫

19、 苗 。 当 前 使 用 的 疫 苗 主 要 是 三 价 灭 活 流 感 疫 苗 和 减 毒 活 疫 苗 3 ， 这 种 疫 苗 主 要 是 产 生 针 对 流 行 株 病 毒 表 面 抗 原HA 和NA 的 特 异 性 抗 体 来 阻 止病毒感染。 虽 然 目 前 在 流 感 病 毒 学 方 面 的 研 究 有 很 大 的 进 步 ， 但 是 现 有 的 疫 苗 生 产 主 要 依 赖 传 统 的 方 法 ， 以 鸡 胚 为 介 质 的 生 产 平 台 ， 整 个 生 产 过 程 需 要 花 费 几 个 月 的 时 间 ， 这 就 导 致 在 流 感 病 毒 大 流 行 时 ， 疫 苗 产

20、量 不 能 够 满 足 接 种 需 求 ， 不 能 提 供 有 效 的 保 护 力 。 同 样 是 在2009 年 爆 发 甲 流 疫 情 时 ， 由 于 传 统 流 感 疫 苗 生 产 工 艺 的 局 限 性 ， 在 流 感 爆 发 的 第 二 个 高 峰 期 时 没 有 足 够 的 疫 苗 供 应 。 这 在 一 定 程 度 上 促 使 大 家 努 力 开 发 新 一 代 的 流 感 疫 苗 4 。 过 去 普 遍 认 为 ， 流 感 病 毒 有 种 属 特 异 性 和 限 制 性 ， 只 能 在 特 定 的 宿 主 细 胞 上 进 行 复 制 ， 一 般 不 会 产 生 跨 种 传 播

21、现 象 。 感 染 人 的 流 感 病 毒 只 能 是 人 流 感 病 毒 或 者 含 有 人 流 感 病 毒 基 因 片 段 的 重 组 病 毒 株 ， 但 是 禽 流 感 病H5N1 直 接 感 染 人 的 病 例 出 现 后 ， 人 们 开 始 认 识 到 ，8 个 基 因 片 段 全 部 来 自 禽 流 感 的 病 毒 也 可 以 感 染 人 。2013 年 禽 流 感 H7N9 病 毒 感 染 人 的 病 例 的 出 现 再 一 次 证 明 了 ， 流 感 病 毒 在 一 定 程 度 上 可 以 打 破 种 属 界 限 ， 跨 宿 主 传 播 。 像H5N1 这 样 的 高 致 病

22、性 禽 流 感 病 毒 能 够 导 致 鸡 胚 死 亡 ， 说 明 以 鸡 胚 为 介 质 的 疫 苗 生 产 平 台 并不适合高致病性禽流感疫苗的生产 3 。 现 在 越 来 越 多 的 报 道 指 出 ， 除 了 体 液 免 疫 产 生 的 抗 体 能 够 起 到 保 护 作 用 外 ， 细 胞 免 疫 反 应 产 生 的 作 用 也 不 容 忽 视 。 当 体 内 不 存 在 抵 抗 病 毒 感 染 的 抗 体 时 ， 预 先 存 在 的T 细 胞 免 疫 记 忆 能 够 减 缓 病 毒 感 染 引 起 的 病 症 5 。T 细 胞 应 答 大 多 是 针 对 病 毒 内 部 比 较 保

23、 守 的 抗 原 表 位 ， 从 而 起 到 更 为 广 泛 而 有 效 的 保 护 作 用 。 目 前 ， 大 多 数 国 家 使 用 的 是 三 价 灭 活 疫 苗 ， 只 有 少 数 的 欧 美 国 家 使 用 减 毒 活 疫 苗 。 灭 活 疫 苗 主 要 引 起 特 异 的 体 液 免 疫 反 应 ， 而 不 能 够 诱 导 有 效 的 细 胞 免 疫 反 应 ； 减 毒 活 疫 苗 被 认 为 能 够 模 拟 病 毒 自 然 感 染 的 过 程 ， 不 仅 可 以 引 起 体 液 免 疫 反 应 和 细 胞 免 疫 反 应 ， 而 且 能 够 激 发 局 部 和 系 统 性 的 免

24、 疫 反 应 ， 能 够 起 到 更 有 效 的 免 疫 保 护 作 用 6 ， 然 而 减 毒 活 疫 苗 只 是 在 特 定 条 件 下 的 减 毒 株 ， 对 于 免 疫 缺 陷 以 及 免 疫 能 力 低 下 的 人 群 是 存 在 潜 在 的 危 害 的 。 由 于 各 种 因 素 的 存 在 ， 这 两 种 疫 苗 对 不 同 年 龄 、 性 别 和 地 域 的 人 群 的 保 护 都 有 差 别 ， 例 如 ， 三 价 灭 活 疫 苗 对1865 岁 的 成 年 人 只 有59% 的 有 效 保 护 率 ； 灭 活 疫 苗 对 儿 童 具有较高的保护率，但是有性别和地域的差异 7

25、 。 综 上 所 述 ， 第 一 ， 流 感 病 毒 每 年 都 会 导 致 上 百 万 人 的 感 染 ， 接 种 疫 苗 是 预 防 流 感 病 毒 感 染 最 为 有 效 的 方 法 。 但 是 由 于 流 感 病 毒 的 多 变 性 ， 使 得 对 流 感 病 毒 的 监 测 和 预 测 存 在 许 多 的 不 确 定 性 ， 这 就 有 可 能 导 致 对 流 感 疫 苗 标 准 株 选 择 的 偏 差 ， 不 能 起 到 及 时 有 效 的 保 护 作 用 。 第 二 ， 目 前 的 传 统 的 以 鸡 胚 为 介 质 的 疫 苗 生 产 平 台 并 不 能 及 时 有 效 地 满

26、 足 社 会 对 疫 苗 的 需 求 ， 尤 其 当 面 临 着 流 感 大 流 行 的 时 候 。 第 三 ， 如 何 能 激 发 免 疫 系 统 的 更 为 全 面 的 反 应 ， 如 何 能 提 供 更 为 广 泛 有 效 的 保 护 作 用 ， 是 大 家 对 流 感 疫 苗 提 出 的 又 一 个 要 求 。 因 此 ， 新 型 广 谱 流 感 疫 苗 研 发 已 经 成 为 了 流 感 疫 苗 研 发 的 热 点 ， 广 谱 流 感 疫 苗 已 经 被 公 认 为 未来流感疫苗发展的主要趋势。 2 广谱流感疫苗靶抗原的相关研究进展 流 感 病 毒 能 够 引 起 体 液 免 疫 反

27、 应 和 细 胞 免 疫 反 应 。 针 对 血 凝 素(HA) 和 神 经 氨 酸 酶(NA) 的 抗 体 能 够 对 流 感 病 毒 的 感 染 起 到 保 护 作 用 ， 针 对 流 感 病 毒 内 部 蛋 白 的 细 胞 免 疫 反 应 则 对 流 感 病 毒 的 清凌志洋 , 等 . 广谱流感疫苗的研究进展 5 表1 广谱流感疫苗潜在靶蛋白 蛋白名称 靶抗原 靶抗原功能 保护机制 血凝素蛋白(HA) HA茎秆区(stem) 介导融合 阻止病毒与感染细胞融合、HA成熟，ADCC 基质蛋白2(M2) M2胞外区(M2e) 离子通道 Fc受体和肺泡巨噬细胞，ADCC，补体依赖的细胞裂解 核

28、蛋白(NP) T细胞表位以及抗体表位 刺激T细胞免疫反应， CD8 + T细胞介导的细胞裂解(CTL)，CD4 + T诱导非中和抗体 细胞介导的细胞裂解以及B细胞激活 基质蛋白1(M1) T细胞表位 刺激T细胞免疫反应 CD8 + T细胞介导的细胞裂解(CTL)，CD4 + T细胞介导的细胞裂解以及B细胞激活 神经氨酸酶(NA) 保守的唾液酸酶活性位点 唾液酸酶 抑制病毒传播 除 是 必 要 的 8 。 而 无 论HA 蛋 白 还 是NA 蛋 白 在 不 同 流 感 亚 型 间 的 变 异 程 度 都 较 大 且 能 够 在 免 疫 压 力 下 发 生 抗 原 漂 变 。 但 是 ， 流 感

29、病 毒 还 有 一 些 亚 型 间 高 度 保 守 的 蛋 白 ， 例 如HA 茎 秆 区 以 及 病 毒 内 部 蛋 白 ， 包 括 核 蛋 白(NP) 、 聚 合 酶 酸 性 蛋 白(PA) 、 基 质 蛋 白(M) 、 膜 离 子 通 道 蛋 白(M2) 。 这 些 蛋 白 是 设 点 、 融 合 肽(fusion peptide) 以 及HA2 的N 端 氨 基 酸 是 所 有 的A 型 流 感 病 毒 亚 型 间 最 保 守 的 序 列 11 。 图2 HA蛋白结构示意图 计 广 谱 流 感 疫 苗 的 潜 在 靶 蛋 白 9, 10 。 综 合 目 前 研 究 ， 在 流 感 病

30、毒 所 有 的11 种 病 毒 蛋 白 中 ，HA 、 M(M1 和M2) 、NP 、NA 等 几 种 蛋 白 作 为 流 感 病 毒 广 谱 疫 苗 的 靶 蛋 白 具 有 较 好 的 前 景 。 下 面 ， 分 别 就 这 几 种 蛋 白 的 性 质 、 作 为 广 谱 疫 苗 的 免 疫 形 式、能够诱导的免疫反应类型等进行具体介绍。 2.1 血凝素蛋白 (HA) HA 是 位 于 流 感 病 毒 脂 质 包 膜 表 面 的 同 源 三 聚 体 跨 膜 糖 蛋 白 ， 由 位 于 包 膜 远 端 的 能 够 介 导 受 体 结 合 的HA 头 部(HA head) 和 位 于 包 膜 近

31、 端 的 介 导 病 毒 包 膜 与 靶 细 胞 膜 融 合 的HA 茎 秆 区(HA stem) 组 成 11 。 HA 在 靶 细 胞 内 以 前 体 的 形 式 被 合 成(HA0) ， 进 而 被 酶 切 为HA1 和HA2 两 个 结 构 域 。HA1 主 要 构 成 HA头部，HA2和HA1的一小部分构成HA茎杆区。 HA 头 部 蛋 白 能 够 诱 导 针 对HA 受 体 结 合 区 的 中 和 性 抗 体 ， 通 过 阻 止 病 毒 与 靶 细 胞 表 面 受 体 结 合 发 挥 中 和 作 用 12 。 通 过 对HA 进 化 的 分 析 发 现 ， 病 毒 可 以 通 过

32、改 变HA1 上 的 糖 基 化 修 饰 位 点 或 者 积 累 点 突 变 来 掩 盖 或 者 改 变 抗 体 识 别 表 位 从 而 逃 脱 抗 体 的 中 和 作 用 13 。 由 于HA 头 部 在 不 同 亚 型 甚 至 同 一 亚 型 不 同 毒 株 之 间 变 异 程 度 较 大 ， 虽 然 有 研 究 组 发 现 了 针 对HA 头 部 受 体 结 合 区 的 有 一 定 广 谱 中 和 性 的 抗 体 14 ， 但 是 针 对 不 同 亚 型 流 感 病 毒 HA 头 部 的 中 和 抗 体 一 般 没 有 交 叉 中 和 活 性 。 因 此 ， 只 是 针 对HA 头 部

33、蛋 白 设 计 的 免 疫 原 可 能 不 会 产生广谱保护活性。 HA 茎 秆 区 在A 型 流 感 病 毒Group1 内 ，Group2 内 以 及B 型 流 感 病 毒 内 是 保 守 的 。HA 的 酶 切 位生命的化学2014 年 34 卷 1 期 6 专题：新兴疫苗 HA 茎 秆 区 的 功 能 是 介 导 病 毒 包 膜 与 靶 细 胞 膜 融 合 ， 对 于 病 毒 基 因 组 释 放 到 感 染 细 胞 内 部 是 至 关 重 要 的 。 在 膜 融 合 的 过 程 中 ，HA 茎 秆 区 会 发 生 结 构 的 变 化 15 ， 对 于 流 感 病 毒 的 复 制 是 必

34、 需 的 ， 因 此 如 果 有 影 响 此 结 构 变 化 的 突 变 发 生 ， 那 么 病 毒 则 不 能 存 活 16 。 这 样 ， 就 暴 露 出 流 感 病 毒 的 一 个 弱 点HA 茎 秆 区 。 这 段 区 域 是 广 谱 中 和 性 抗 体 ， 广 谱 疫 苗 甚 至 抗 病 毒 药 物 的 靶 点 。HA 茎 秆 区 位 于HA 头 部 蛋 白 的 下 面 ， 不 是 主 要 的 抗 原 表 位 ， 抗 原 性 较 弱 ， 而 且 在 不 同 亚 型 毒 株 中 相 对 比 较 保 守 。 针 对HA 茎 秆 区 的 抗 体 虽 然 在 数 量 以 及 中 和 效 果

35、上 都 不 及 针 对HA 头 部 蛋 白 的 抗 体 ， 但 是 由 于 流 感 头 部 抗 原 的 变 化 使 得 免 疫 系 统 针 对 头 部 的 抗 原 的 记 忆 不 会 充 分 地 加 强 ， 对HA 茎 秆 区 抗 原 表 位 的 记忆却会随着病毒持续的感染不断得到加强 17 。 中 和 性 抗 体 是 阻 止 病 毒 感 染 的 最 首 要 的 因 素 。 现 在 广 泛 使 用 的 三 价 季 节 流 感 病 毒 疫 苗 所 诱 导 的 抗 体 基 本 都 是 针 对HA 蛋 白 的 头 部 ， 近 年 ， 有 陆 续 报 道 ， 发 现 了 一 些 具 有 广 谱 中 和

36、 活 性 的 抗 体 ， 它 们 所 识 别 的 抗 原 表 位 ， 就 是 针 对 相 对 比 较 保 守 的HA 茎 秆 区 的 一 些 氨 基 酸 。 最 早 发 现 的 这 类 抗 体 ， 是1993 制 备 的 鼠 源 单 克 隆 抗 体C179 18 ， 能 够 中 和Goup1 的 流 感 病 毒 。2009 年 猪 流 感 爆 发 后 ， 从 病 人 或 疫 苗 免 疫 志 愿 者 体 内 分 离 出 具 有 广 谱 中 和 活 性 的 抗 体 ， 能 够 中 和 不 同 毒 株 甚 至 不 同 亚 型 的 流 感 病 毒 ， 然 而 这 些 抗 体 几 乎 都 是 针 对HA

37、 茎 秆 区 的 19, 20 。 大 多 数 针 对HA 茎 秆 区 的 抗 体(CR6261 ， F10 ，FI6 和C179) 都 识 别 类 似 的 空 间 表 位 ， 这 类 广 谱 中 和 抗 体 并 不 能 改 变HA 三 聚 体 的 结 构 ， 但 是 能 够 阻 止 低pH 诱 导 的HA2 蛋 白 结 构 变 化 21-26 。 其 发 挥 中 和 作 用 的 机 制 是 阻 止 病 毒 与 宿 主 细 胞 膜 融 合 的 过 程 。 识 别HA 茎 秆 区 的 广 谱 中 和 性 抗 体 的 发 现 以 及 表 位 鉴 定 ， 为 广 谱 流 感 疫 苗 的 研 发 提

38、供 了 证 据和新思路 27 。 表2 识别HA茎秆区的抗体 抗体名称 来源 反应性 表位 V 基因 FI6 人外周血细胞培养分离，经过序列优化 Group1， 融合肽， VH3-30，Group2 -螺旋 V 4-1 F10 噬菌体库，H5亚型HA筛选 Group1 -螺旋 VH1-69 CR6261 人IgM记忆B细胞构建噬菌体库，H5亚型HA筛选 Group1 -螺旋 VH1-69 CR8020 永生化的人记忆B细胞，荧光标记的H3亚型HA筛选 Group2 折叠， VH1-18，融合肽 V 3-18 IF2,1F4， 人记忆B细胞，荧光标记的H1亚型HA筛选 Group1， 融合肽，

39、VH3-23， 1G1 Group2 -螺旋 V 3-15 HA 茎 秆 区 的 免 疫 原 性 与HA 头 部 相 比 要 弱 得 多 。 主 要 原 因 有 以 下 两 点 ：(1) 在 流 感 病 毒 表 面 ， 在HA 头 部 结 构 中 存 在 有 许 多 优 势 抗 原 表 位 ， 它 们 阻 碍 了HA 茎 秆 区 中 的 弱 势 抗 原 表 位 被 机 体 的 免 疫 系 统 所 识 别 。(2) 茎 秆 区 非 常 接 近 病 毒 包 膜 ， 由 于 空 间 位 阻 效 应 而 影 响 免 疫 细 胞 的 识 别 28 。 因 此 ， 设 计 针 对HA 茎 秆 区 的 流

40、感 广 谱 疫 苗 的 最 大 挑 战 就 是 如 何 能 有 效 诱 导 出 针 对 免 疫 原 性 较 弱 的HA 茎 秆 区的抗体，以发挥抗体的广谱中和作用。 目 前 有 两 种 疫 苗 形 式 能 够 诱 导 广 谱 的 交 叉 保 护 性 中 和 抗 体 ， 其 一 是 根 据 识 别HA 茎 秆 区 的 广 谱 中 和 性 抗 体 的 表 位 或HA0 酶 切 位 点 等 设 计 的 多 肽 疫 苗 29, 30 ； 比 较 典 型 的 研 究 是 ： 基 于H3 亚 型 高 度 保 守 的HA2 -helix 的 合 成 肽 疫 苗 能 够 诱 导 小 鼠 产 生 不 同 水 平

41、 的 针 对H5 和H1 亚 型 的 保 护 性 免 疫 反 应 31 。 这 种 多 肽 疫 苗 是 基 于 识 别HA2 并 且 中 和H3 亚 型 一 些 不 同 毒 株 的 流 感 病 毒 的 鼠 源 单 克 隆 抗 体(12D1) 的 表 位 设 计 的 32 。 另 外 一 个 基 于12D1 表 位 疫 苗 设 计 是 使 用 大 肠 杆 菌 表 达 系 统 表 达 了H3 亚 型HA 茎 秆 区 ， 但 是 这 种 免 疫 原 只 能 使 小 鼠 在H3 亚 型 病 毒 的 攻 击 实 验 中 存 活 ， 而H1 亚 型 的 攻 击 则 不 能 存 活 33 。 另 外 一 种

42、 是 基 于 全 长 或 截 短 的HA 蛋 白 。 这 类凌志洋 , 等 . 广谱流感疫苗的研究进展 7 疫 苗 设 计 致 力 于 削 弱 占 免 疫 优 势 的HA 头 部 的 免 疫 反 应 同 时 增 强HA 茎 秆 区 的 免 疫 反 应 ， 这 里 列 举 三 种 不 同 的 策 略 。(1) 构 建 缺 失 了 头 部 的HA 蛋 白 作 为 免 疫 原 。 对 小 鼠 免 疫 表 达H2N2 亚 型 的 此 种 免 疫 原 的 细 胞 能 够 完 全 保 护 小 鼠 免 受 同 亚 型 的 病 毒 攻 击 ， 但 是 只 能 部 分 保 护 小 鼠 免 受 不 同 亚 型 病

43、 毒 攻 击 34 ；另外，共同免疫基于H1N1以及H3N2亚型的 缺 失 了 头 部 的HA 蛋 白 的DNA 疫 苗 和VLP 疫 苗 保 护 小 鼠 免 受 不 同 亚 型 病 毒 攻 击 的 效 果 较 弱 35 。(2) 使 用 抗 原 性 完 全 不 同 的 病 毒 进 行 加 强 免 疫 。 这 种 疫 苗 设 计 包 括 很 多 不 同 的 形 式 ：DNA 疫 苗 多 次 免 疫 32 ； DNA 疫 苗 进 行 初 次 免 疫 ， 灭 活 病 毒 疫 苗 或 腺 病 毒 载体疫苗进行回忆刺激 36, 37 ；或者依次感染不同亚 型 的 病 毒 38, 39 。 这 些 疫

44、苗 形 式 免 疫 的 动 物( 小 鼠 、 雪 貂 等) 都 获 得 了 一 定 的 广 谱 保 护 活 性 。(3) 基 于 嵌 合HA 蛋 白 的 广 谱 流 感 疫 苗 取 得 了 很 好 的 效 果 ， 其 疫 苗 设 计 是 基 于 相 同 的HA 茎 秆 区 。 使 用 不 同 亚 型 流 感 病 毒 的 的HA 头 部 与 相 同 的HA 茎 秆 区 构 建 嵌 合 蛋 白 40 ， 分 别 免 疫 小 鼠 ， 以 此 来 获 得 并 加 强 机 体 针 对HA 茎 部 保 守 表 位 的 广 谱 性 抗 体 。 经 过 三 次 不 同 嵌 合 蛋 白 的 免 疫 ， 并 使

45、用 与 之 前 免 疫 所 使 用 的HA 头 部 不 同 亚 型 的 重 组 病 毒 进 行 攻 击 ， 结 果 显 示 ， 对 于 大 多 数 病 毒 都 产 生 了 完 全 的 保 护 作 用 41, 42 。 使 用 这 种 疫 苗 形 式 ， 能 够 使 针 对HA2 的 抗 体 在 每 一 次 加 强 免 疫( 回 忆 刺 激) 的 过 程 中 得 到 加 强 。 这 种 嵌 合HA 蛋 白 可 以 很 好 地 包 装 出 重 组 流 感 病 毒 ， 能 够 很 方 便 地 利 用 现 有 的 疫 苗 生 产 体 系 进 行 生 产 。 这 种 疫 苗 设 计 有 着 很 好 的

46、效 果 ， 是 很 有 潜 力 的 一 种广谱流感疫苗 43 。 2.2 M2e 蛋白 M2 蛋 白 是 一 种 膜 蛋 白 44 ， 是pH 依 赖 的 质 子 通 道 蛋 白 45 ， 对 于HA 蛋 白 成 熟 以 及 病 毒 基 因 组 的 释 放 至 感 染 细 胞 都 有 重 要 的 作 用 。M2 蛋 白 可 以 作 为 广 谱 流 感 疫 苗 的 靶 蛋 白 基 于 以 下 两 点 ：(1) 对 小 鼠 过 继 免 疫 一 种 抗M2 的 单 克 隆 抗 体 能 够 降 低 病 毒 攻 击 后 小 鼠 肺 部 病 毒 的 复 制 46 。(2)M2 胞 外 区(M2e) 序 列

47、 在 所 有A 型 流 感 病 毒 都 是 保 守 的 。 但 是 ， 在 流 感 病 毒 感 染 47 以 及 重 组 蛋 白 免 疫 的 情 况 下 ， 针 对 M2e 的 抗 体 反 应 十 分 微 弱 48 。 因 此 ， 一 些 研 究 致 力 于 克 服M2e 的 低 免 疫 原 性 ， 包 括 将M2e 与 免 疫 原 性 较 强 的 载 体 蛋 白 融 合 表 达 49 ， 构 建 表 达M2e 的VLP 等 50-52 。M2e 介 导 的 保 护 作 用 可 能 是 通 过 抗 体 依 赖 的 细 胞 介 导 的 细 胞 毒 性 作 用(ADCC) 53 ， 补 体 介 导

48、 的 细 胞 裂 解 作 用(complement-mediated lysis) 发 挥 的 54 。 2.3 神经氨酸酶 (NA) NA 是 四 聚 体 糖 蛋 白 ， 位 于 病 毒 表 面 ， 有 水 解 唾 液 酸 的 活 性 ， 对 于 病 毒 从 宿 主 细 胞 中 释 放 有 重 要 作 用 。NA 是 流 感 治 疗 药 物 的 一 个 作 用 靶 点 ， 针 对NA 设 计 的 奥 司 他 韦 是 最 著 名 的 抗 流 感 药 物 之 一 。 虽 然 有 很 多 基 于NA 为 靶 点 的 流 感 疫 苗 的 研 究 ， 但 是 普 遍 认 为 单 独 免 疫NA 并 不

49、 能 阻 止 流 感 病 毒 的 感 染 。 尽 管 如 此 ，NA 诱 导 的 免 疫 反 应 能 够 减 缓 病 毒 感 染 子 代 细 胞 并 且 能 够 减 轻 感 染 后 的 严 重 程 度 。 杆 状 病 毒 表 达 的N1 亚 型 的NA 病 毒 样 颗 粒 免 疫 小 鼠 能 够 诱 导 出 识 别 不 同 亚 型NA 的 抗 体 ， 保 护 小 鼠 免 受 致 死 剂 量 的 同 亚 型(H1N1) 和 不 同 亚 型 (H3N2) 的 病 毒 攻 击 并 且 能 够 降 低 肺 部 病 毒 复 制 55 。 2.4 核蛋白 2(NP) 和基质蛋白 (M1) NP 与 流 感 病 毒 的 遗 传 物 质- 单 股 负 链RNA(ss- RNA) ， 缠 绕 成 核 糖 核 蛋 白 体(RNP) 。M1 构 成 了 病 毒 的 外 壳 骨 架 ， 与 病 毒 最 外 层 的 包 膜 紧 密 结 合 ， 有保护病毒核心和维系