1、第一章1、生物技术与生物分离的关系是什么？为什么说生物分离过程是生物技术的重要组成部分？生物技术的主要目标是生物物质的高效生产，而分离纯化是生物产品工程的重要环节。因此，生物分离是生物技术的重要组成部分。2、生物物质有哪些？现代生物技术产品的主体是什么？生物物质总类繁多，包括小分子化合物，生物大分子，超大分子，细胞和具有复杂结构与组成成分的生物体组织。现代生物技术产品的主体-蛋白质类药物.1) 细胞因子:干扰素、生长因子、红细胞生成素2) 激素：胰岛素、生长激素3) 抗体药物：单克隆抗体、抗体片段4) 酶类药物：尿激酶5) 基因工程疫苗6) 基因治疗3、生物分离过程设计应考虑哪些因素？为什么色
2、谱是分离过程的核心技术？考虑因素：1) 目标产物的存在位置：胞内或胞外2) 目标产物的存在形式：活性表达产物或包含体3) 目标产物分子的大小、疏水性、电荷性质、溶解度和稳定性4) 目标产物的商业价值和对纯度的要求4、生物分离过程有哪些特点？1) 生化产物的稳定性差，产物可能失活2) 分离难度大，一般需用特殊的高效分离技术3) 生物产物的原料构成成分复杂，需要采用多种分离技术和多个分离步骤完成一个目标产物的分离4) 对最终产物的质量要求很高5) 需对原料液进行高度浓缩5、生物分离过程中需要考虑分离对像的哪些性质？1) 根据物理性质的差异实现分离i. 力学性质：密度、尺寸和形状。用于重力沉降、离心
3、、膜分离等ii. 热力学性质：溶解度、挥发度等。用于如蒸馏、蒸发、结晶、吸附和离子交换等iii. 传质性质：粘度、扩散系数、热扩散现象等。即利用传质速度的差别进行分离iv. 电磁性质：荷电性质、电荷分布、等电点等。用于电泳、电渗析、离子交换、磁性分离等2) 根据化学性质的差异实现分离i. 化学性质包括热力学(化学平衡)、反应动力学(反应速率)和光化学特性等。ii. 化学吸附和化学吸收即利用化学性质实现分离。3) 根据生物学性质的差异实现分离a) 生物分子间的识别作用，如亲和色谱b) 利用酶的立体选择性，如对手性分子进行选择性修饰后以增大分子间差异，从而用常规方法进行分离6、什么是平衡分离？什么
4、是差速分离？差速分离（速度分离）分离机理：根据溶质在外力作用下产生的移动速度的差异实现分离。传质推动力主要有压力差、电位梯度和磁场梯度等；分离方法：超滤、反渗透、电渗析和电泳等；扩散分离（平衡分离）分离机理：根据溶质在两相中分配平衡状态的差异实现分离。传质推动力为偏离平衡态的浓度差；分离方法：萃取、结晶、吸附和离子交换等。7、如何对分离效率进行评价？1) 从分离方法和设备的角度i. 分离容量：单位体积的分离设备处理料液或目标产物的体积或质量；ii. 分离速度：单批次分离所需时间；iii. 分辨率：目标产品的纯化效果或杂质的去除能力2) 从分离过程和产品的角度i. 浓缩程度ii. 分离纯化程度i
5、ii. 回收率8、为什么分离因子 要足够大？9、如何确定产品的回收率？第二章1、细胞重力沉降速度的计算CPXWTCPAcm2、离心沉降速度的计算3、常用离心分离设备有哪些？实验室主要使用离心管式转子离心机；生化上需用冷冻离心机；工业上较常用的有管式和碟片式两大类。4、离心机的处理能力如何计算？如何放大？管式 碟式;离心机的放大：采用等校正系数法5、导出恒压过滤速度基本方程，如何确定过滤系数 K？6、细胞破碎的原理是什么？什么是机械破碎？什么是化学破碎？机械破碎：原理是细胞在机械作用力下受到压缩和剪切而破碎。细胞越小，所22 (2.3)ggLrQvv 2g2()=, (.6)3tan112r-Q
6、式 中 ， 和 分 别 为 分 离 板 的 外 径 和内 径 ； 为 分 离 板 数 ； 为 分 离 板 与旋 转 板 轴 的 夹 角1221gQ=, (.7)2L() (2.3)()() (.)1-= (2.34)() 2.32sL0L200ss000Ap-cdQt+KtApcQt恒 压 条 件 下 ：其 中 ：上 式 中 ， 为 料 液 中 固 形 成 分 形 成 滤 饼的 含 量 ， 为 湿 滤 饼 和 干 滤 饼 的 质 量 比 ，为 形 成 相 当 于 过 滤 介 质 阻 力 的 滤 饼 时透 过 的 虚 拟 滤 液 体 积 ， 为 透 过 虚 拟 滤 液量 所 需 的 虚 拟 时
7、间 。对 微 分 可 得 ： 2.35.50dt=+KQ由 式 可 计 算 和需压缩或剪切力越大，越难破碎。化学破碎又称化学渗透：其原理是利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的溶出速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。7、为什么细胞直径越小，越难破碎？由 2.37 和 2.39 可见，单纯从细胞直径的角度，细胞越小，所需的压缩力或剪切力越大，即破碎的难度越大8、在产物释放速度模型中，什么是破碎速度控制过程？什么是释放速度控制过程？9、各种机械破碎方法的原理是什么？各有何优缺点？机械破碎处理量大、效率高、速度快，是工业规模细胞
8、破碎的主要手段1 高压匀浆破碎原理：主要利用细胞悬液在高压作用下液相剪切力以及细胞与固定表面的撞击力而使之破碎。 特点：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜用于团状或丝状菌的破碎；由于操作中温度会升需对料液作冷却处理，保护目的产物活性。2 珠磨破碎破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相互磨擦碰撞而破碎。特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低， 设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。3 撞击破碎破碎原理：细胞冷冻后成为易于破碎的刚性球体，高速撞击固定的撞击板使其破碎。特点：细胞破碎均匀；可通过调节载气压力控制细胞破碎程度；适用于细胞器（
9、如线粒体、叶绿体）的回收。4 超声波破碎破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 特点：它是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效能量利用率极低，对冷却的要求相当苛刻，故不易放大，多在实验室使用。(2.37)4F=d4= (2.39)duy2.413 (2.4) (2.4a) .b()()=()DRDRMDMRdcdc+k=k-cttdck-t由 式 可 得 ：上 式 即 为 两 步 释 放 过 程 的 速 率 方 程 。 如 果 细 胞 破 碎 和 产 物释 放 的 其 中 一 步 很 快 ， 则 成 为 表 观 一 级 释 放 过 程 ， 速 率 方程
10、分 别 为 ：破 碎 速 率 控 制 过 程 ：释 放 速 率 控 制 过 程 ：10、化学和生物化学渗透破碎有哪些方法？与机械破碎相比有什么优缺点？1 酸碱处理 破碎原理：蛋白质为两性电解质，改变 PH 值可以改变其荷电性质，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的相互作用力降低而易于溶解。2 化学试剂处理破碎原理：表面活性剂、螯合剂、有机溶剂或变性剂等处理细胞，增大细胞壁或细胞膜的通透性，或者降低胞内物质间相互作用，使目的产物易于释放。3 酶溶破碎原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，增大胞内产物的通透性。机械破碎法优点：处理量大、破碎效率高、速度快，适用于工业规模的细胞破碎。缺点：由于操作条
11、件比较剧烈，往往容易造成细胞的过度破碎，不利于后续处理。化学破碎法优点：选择性高，胞内产物的总释放率低，料液粘度小，有利于后处理过程。缺点：适用范围小，通用性差，破碎速度慢，处理时间长，破碎效率低，不适于大规模细胞破碎操作。11、物理渗透法破碎有哪些方法？其原理是什么？渗透压冲击法破碎原理：细胞在高渗透压介质中平衡后，再突然将其转至低渗透压环境中，水会大量进入细胞，使细胞壁和膜胀破。特点：最温和的细胞破碎法；适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。冻结融化法破碎原理：利用细胞在快速冷冻时，细胞内水很快结晶，形成大量晶核，体积增大，将细胞胀破， 经冻结融化反复多次操作，即可达到所需的破碎
12、率。特点：此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细胞，特别适用于位于胞间质的酶的释放；操作方便，但耗时、耗能，大规模应用困难。第四章1. 什么是沉淀？它与结晶的区别在哪里？1 定义：沉淀（Precipit-tion）是物理环境的变化引起溶质溶解度降低，生成固体凝聚物的现象。2 与结晶的区别a) 沉淀的纯度远低于结晶，是一种初级分离技术。但多步沉淀操作也可制备高纯度的目标产物。b) 目前广泛应用于蛋白质等生物产物的分离。c) 蛋白质沉淀是不定形颗粒，不是结晶。2. 水溶液中的蛋白质的表面特性有哪些？a) 蛋白质是两性高分子电解质，主要由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成，蛋白质的疏水特性是一重要
13、性质；b) 蛋白质的相对分子量在 51031106 之间，分子直径约 130nm；c) 在水溶液中呈胶体性质，在蛋白质周围形成水化层，水化层可达蛋白质分子质量的 2 倍以上；胶体性质是蛋白质的又一重要性质d) 分子间由于形成双电层而存在静电排斥作用。3. 蛋白质的双电层是指什么？对沉淀分级有何指导意义？a) 带电离子间的静电相互作用取决于 电位(绝对值)的大小，b) 由于粒子表面电位一定，所以分散层厚度越小， 电位越小，c) 若分散层厚度为零，则 电位为零，粒子处于等电状态，不产生静电相互作用，d) 当双电层的 电位足够大时，静电排斥作用等于抵御分子间的相互吸引作用( 分子间力) ，使蛋白质溶
14、液处于稳定状态。因此：1) 可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度( 电位)降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀；2) 水化层厚度和 电位与溶液性质(如电解质的种类、浓度、pH 值等)密切相关；3) 蛋白质沉淀可采用恒温条件下添加各种不同试剂的方法：加入无机盐的盐析法，调节 pH 的等电点沉淀法，加入有机溶剂的有机溶剂沉淀法。4. 盐析沉淀的原理是什么？影响因素有哪些？高盐浓度下，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱；同时，由于盐离子的水化作用使蛋白质表面疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出疏水区域，从而增大了蛋白质表面疏水区之间的疏水相互作用，容易发生凝聚，进而沉淀。影响因素：
15、无机盐种类（影响)：离子半径小而带电荷较多的阴离子盐析效果较好。温度和 pH 值（主要影响 ） ，蛋白质起始浓度的影响。5. 为什么常用硫酸铵作为盐析用盐？如何进行盐析沉淀操作？6. 等电点沉淀的原理及操作条件？为什么亲水性太强的蛋白质不适合于等电点沉淀？1 定义：利用蛋白质在 pH 等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法。2 原理： 在等电点附近，蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水作用力使分子间相互吸引，形成沉淀。3 操作条件：低离子强度；pHpI，由于一般蛋白质的等电点在偏酸性的范围内，故等电点操作中多通过加入无机酸，如盐酸、磷酸和硫酸等调节 pH
16、。4 一般适用于疏水性较大的蛋白质（如酪蛋白） ，而对于亲水性很强的蛋白质（如明胶）则不太适用，故其不如盐析沉淀法应用广泛。7. 有机溶剂沉淀的原理是什么？应注意什么问题？1 定义：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，造成蛋白质分子表面水化程度降低，蛋白质分子间的静电引力增大，从而发生沉淀的方法。2 原理：加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生多种效应，这些效应结合起来，使蛋白质沉淀。其中主要效应是水的活度的降低，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，因而静电引力增大。也有可能是因为有机溶剂的加入使蛋白质的键如氢键等受到破坏，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内
17、部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀，当蛋白质的空间结构发生变形超过一定程度时，便会导致完全变性。3 操作条件：低离子强度；等电点附近。4 优缺点：优点：有机溶剂密度较低，易于沉淀分离；不需后续脱盐处理；缺点：易引起蛋白质变性，须在低温下进行。5 注意事项：a) 降低温度，能增加收率和减少蛋白质的变性所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不起作用，最常用的溶剂是丙酮和乙醇，工业上最常用的是乙醇；b) 蛋白质的分子量越大，产生沉淀所需加入的有机溶剂量越少；c) 一种蛋白质的溶解度通常会由于另一种蛋白质的存在而降低；d) 对很多酶，丙酮加量在 20%-50%
18、之间，就能产生沉淀；e) 接近等电点时，以引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少；f) 当溶剂量达到 50%时，则通常只有分子量小于 15000 的蛋白质仍留在溶液中；g) 少量中性盐的存在(0.1-0.2mol/L 以上)能产生盐溶作用，增加蛋白质在有机溶剂水溶液的溶解度，使所需的有机溶剂量增大。8. 沉淀生成的动力学方程9. 泡沫分离的原理是什么？影响泡沫分离的因素有哪些？a) 表面张力与表面吸附i. 在水溶液中加入表面活性剂形成胶团。在气液界面处，极性头溶于水相，而非极性尾部暴露在气相中(气泡内)；ii. 不同溶质在气泡表面的吸附量(浓聚)不同，从而实现分级。iii. 根据热力学理论，在气液两
19、相界面处的表面活性物质浓度与主体溶液不同，这种现象称为表面过剩。b) Gibbs 等温吸附方程:溶质的表面过剩量可用 Gibbs 吸附等温式表达影响因素：1 料液性质：pH、离子强度，添加剂等。 2 表面活性剂：对于非表面活性物质的泡沫分离，可以提高目标蛋白质的分离度和收率；3 操作条件：主要是气体流速。4 泡沫柱高度。 第四章1. 膜分离方法有哪些，其分离原理是什么？2. 图示说明反渗透的原理在溶质浓度高的一侧施加超过渗透压的压力，使溶剂透过膜的操作。3. 超滤和微滤的分离原理与反渗透有何区别？一般来讲，反渗透法主要用于截留无机盐类这样的小分子，而超滤则是从小分子溶质或溶剂分子中，将比较大的
20、溶质分子筛分出来。二者并无本质上的差别。4. 透析的原理是什么？在生化分离中有何用途？利用透析膜（具有一定孔径大小，高分子溶质不能透过的亲水膜）将料液与透析液（纯水或缓冲液）分隔，在浓差作用下，料液中小分子溶质进入透析液，而透析液中的水进入料液。应用：临床上常用于血液透析；生物分离中主要用于生物大分子溶液的脱盐。特点：以浓差为推动力，膜透过通量很小，不适于大规模生物分离过程，多在实验室中应用。5. 电渗析的工作原理是什么？膜 分 离 法 传 质 推 动 力 分 离 原 理 应 用 举 例 微 滤 (MF) 压 差(0.50.5MPa) 筛 分 除 菌 ， 回 收 菌 体 ， 分 离 病 毒 超
21、 滤 (UF) 压 差(0.11.0MPa) 筛 分 蛋 白 质 等 大 分 子 的 回 收 与 浓 缩 反 渗 透 (RO) 压 差(1.010MPa) 筛 分 脱 盐 ， 淡 水 制 造 透 析 (DS) 浓 度 差 筛 分 脱 盐 ， 除 变 性 剂 电 渗 析 (ED) 电 位 差 荷 电 、 筛 分 脱 盐 ,氨 基 酸 与 有 机 酸 的 分 离 渗 透 气 化 (PV) 压 差 、 温 差 溶 质 与 膜 的 亲 和 作 用 共 沸 物 的 分 离 （ 如 乙 醇 浓 缩 ） 使用离子交换膜，利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法6. 渗透汽化的工作原理是什么？通过
22、渗透气化膜，在膜两侧溶质分压差的作用下，根据溶质间透过速度的不同，并在透过侧发生气化，使液体混合物得到分离的膜分离法特点：溶质发生相变，消除了渗透压的作用，可在较低压力下进行，适于高浓度混合物的分离；特别适用于共沸物和挥发度相差较小的双组分溶液的分离。7. 对膜材料有哪些要求？a) 有效膜厚度小，UF 和 MF 膜孔隙率高，过滤阻力小；b) 膜材料为惰性，不易污染和堵塞；c) 适用的 pH 和温度范围广，稳定性高，使用寿命长；d) 容易通过清洗恢复透过性能；e) 能满足实现分离目的的各种要求。8. 膜的结构特征包含哪些内容？1 孔道结构因膜材料和制造方法而异，对膜的透过通量和耐污染能力等操作性
23、能有重要影响。孔道特性包括孔径、孔径分布和孔隙率。9. 什么是膜的水通量？i. 定义：在一定条件下（一般压力为 0.1MPa，温度为 20) ，单位时间透过单位膜面积的纯水体积。ii. 膜材料、生产工艺和膜孔径影响水通量大小。iii. 实际操作中由于溶质吸附、膜孔堵塞及浓度极化等原因会使透过通量大幅度降低。10. 膜组件有哪些形式？由膜、固定膜的支撑体、间隔物及收纳这些部件的容器构成的一个单元。11. 试导出浓差极化模型12. 有哪些因素影响膜的截留率？i. 溶质分子量式毛 细 管中 空 纤 维螺 旋 卷 式平 板 式管 式 )(ii. 分子特性1. 不同分子截留率大小顺序：球形带支链线性；2
24、. 对于荷电膜，与膜相反电荷的分子截留率较低；3. 若膜对溶质有吸附作用，截留率增大。iii. 其他高分子溶质的影响1. 其他高分子溶质的存在使溶质截留率增大。iv. 操作条件1. 温度升高(使粘度降低)，膜面流速提高，截留率降低；2. pH=pI 时，蛋白质在膜表面形成的凝胶极化层浓度最大，即透过阻力最大。因此，此时的溶质截留率高于其他 pH 下的截留率13. 影响膜分离速度的因素有哪些？操作方式 流速压力料液浓度14. 膜分离操作中浓缩与洗滤有何区别？15. 膜分离在生化分离中的应用领域第五章1、什么是萃取、反萃取、萃取洗涤？萃取：利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作
25、。反萃取：调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的操作。作用：为了进一步纯化目标产物或便于后续分离操作。洗涤：有时加在萃取与反萃取之间，除去与目标产物同时萃取到有机相的杂质，提高反萃液中目标产物纯度。2、物理萃取和化学萃取有何区别？1) 物理萃取定义：溶质根据相似相溶原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质间不发生化学反应。应用：广泛应用于抗生素及天然植物中有效成分的提取。如利用乙酸丁酯萃取青霉素。2) 化学萃取定义：利用脂溶性萃取剂与溶质的化学反应生成脂溶性复合分子，使溶质向有机相分配。应用：用于氨基酸、抗生素和有机酸等生物产物的分离回收。如利用季铵盐萃取氨基酸。3、萃取平衡的分配定律是什么
26、？分配系数是如何定义的？分配定律：一定温度、压力下，溶质在互不相溶的两相中达到分配平衡后，在两相的浓度比为一常数,即分配系数 m。 4、导出弱电解质的分配系数表达式5、导出化学萃取平衡的分配系数表达式6、哪些条件对溶剂萃取操作产生影响？为什么？1 萃取剂2 水相 pH对弱电解质萃取，水相 pH 影响分配系数,如青霉素 .3 温度 生化产物在温度较高时都不稳定，故萃取应维持在室温或较低温度下进行。个别情况下，为提高萃取速度可适当提高萃取温度。温度对萃取分配系数也有影响。4 无机盐 加入无机盐如硫酸铵、氯化钠等可使产物在水中的溶解度降低，而易于转入到溶剂中去；另一方面也能减少有机溶剂在水中的溶解度
27、。如在提取维生素 B12时，加入硫酸铵；在提取青霉素时加入氯化钠等。5 助萃剂(化学萃取剂，带溶剂) 当目标产物的水溶性太强，通常在有机溶剂中的溶解度很小时，难于用萃取的方法进行分离。此时可在有机溶剂中加入助萃剂，其作用是使其与目标产物形成复合物，从而增大目标产物在有机溶剂中的溶解度6 乳化现象(萃取过程中极易发生)影响：两相分层困难，并产生两种夹带萃余液中夹带有机溶剂，造成目标产物损失；萃取相中夹带萃余液，给后处理带来困难。7、导出多级错流萃取、多级逆流萃取、及分馏萃取的萃取分率计算式8、建立微分萃取的平推流及轴扩散模型9、双水相萃取的原理及特点是什么？某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定
28、浓度后可形成两相系统；两相中水分占有很大比例，达 85-95%；生物活性物质在这种环境中不会引起失活，但可以不同的比例分配于两相中。10 影响分配系数(萃取效果)的因素1 成相聚合物和浓度分子量：降低聚合物的分子量，则蛋白质易于分配于富含该聚合物的相中。总浓度：越大则两相性质的差别越大，系线越长，蛋白质越容易分配于其中的某一相。2 盐的种类和浓度影响 ：影响 HFS：由于盐析作用，盐浓度增加则蛋白质表面疏水性增大。影响双水相系统：改变上、下相中成相物质的组成和相体积比。3pH 值影响蛋白质的表面电荷数 Z：影响蛋白质的解离度。影响 ：影响磷酸盐的解离。4 温度主要影响双水相系统的相图。大规模双
29、水相萃取操作一般在室温下进行，主要基于以下考虑：PEG 对蛋白质有稳定作用；溶液粘度较低，容易相分离；节省冷却费用。11、什么是液膜萃取？有支撑液膜和无支撑液膜萃取的区别在哪里？各有何优缺点？定义：液膜是由水溶液或有机溶剂（油）构成的液体薄膜，将与之不能互溶的液体分隔开来，使其中一侧液体中的溶质选择性透过液膜进入另一侧，实现溶质间的分离。特点：液膜结构独特，分离性能高效，可实现萃取和反萃取一步完成。应用：有机酸、氨基酸和抗生素等小分子生物产物的分离纯化。12、影响液膜萃取操作的因素有哪些？为什么？膜相组成1 膜溶剂 粘度影响乳状液膜稳定性、液膜厚度和传质系数；当分离需要流动载体时，应对其有较高
30、的溶解度。2 表面活性剂 操作条件1pH 值 对氨基酸和有机酸等弱电解质的萃取，pH 影响其电离，从而影响萃取率。 2 搅拌速度 影响乳化液的分散和液膜的稳定性，过低则操作时间长；过高则液膜易被破坏。3 反萃相 对于型和型促进迁移的萃取过程，反萃相组成和浓度影响萃取速度和选择性。4 操作温度 一般在常温下进行，因过高虽然可提高萃取速度，但同时膜相挥发速度加快，甚至造成表面活性剂水解，对维持液膜稳定性不利。5 操作时间 因乳状液膜为高度分散体系，相间接触比表面积极大，且液膜很薄，传质阻力小，故在短时间内可萃取完全。时间过长反而会引起液膜的破坏。13、什么是反胶团？反胶团萃取与液液萃取有什么区别？
31、向有机溶剂中加入表面活性剂（如 AOT） ，浓度超过一定值时，形成反胶团. 与一般有机溶剂萃取的区别：利用表面活性剂在有机相中形成反胶团（reversed micelles)，从而在有机相内形成分散的亲水微环境。生物分子可溶解在反胶团的亲水微环境中，消除了蛋白质类生物活性物质难溶解在有机相中，或在有机相中发生变性的现象。14、反胶团的溶解作用有哪几种？为什么反胶团萃取中酶可能失活？a) 反胶团溶解蛋白质的形式，有人提出四种模型：i. 水壳模型；ii. 蛋白质分子表面疏水区域直接与有机相接触；iii. 蛋白质吸附于反胶团内壁；iv. 蛋白质疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾相互作用，被几个小反
32、胶团“溶解15、什么是超临界流体萃取？为什么 CO2 常作为超临界流体？定义：利用超临界流体（SCF） ，即温度、压力略超过或靠近临界温度和临界压力的流体为萃取剂，从固体或液体原料中提取目的产物。最常用的超临界流体：CO2，因其临界温度接近常温，无毒、化学稳定性高、价廉。CO2 的 p-V()-T 图：临界点附近温度或压力的微小变化，引起密度发生很大变化。第六章1. 影响吸附的主要因素？2. 亲和吸附的原理和特点是什么？3. 常用的离子交换树脂类型有哪些？常用的离子交换树脂1 强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基） ；2 弱酸性阳离子交换树脂：活
33、性基团有-COOH, -OCH2COOH, C6H5OH 等弱酸性基团；3 强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-羟基乙基胺基；弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱4. 影响离子交换速度的因素有哪些？5. 用于蛋白质提取分离的离子交换剂有哪些哪些特殊要求，主要有哪几类？i. 要求：良好的亲水性、具有较大的均匀网格结构、粒度越小分辨率越高ii. 种类：多糖类 离子交换纤维素交联葡聚糖交联琼脂糖聚乙烯醇类Mono 系列 Amersham Pharmacia第 7 章1. 色谱工作原理2. 色谱的分类a) 按流动相和固定相分：按流动相有气相色谱、液相色谱、超临
34、界流体色谱；按固定相有固体、液体和以固体为载体的液体薄层。生物分离主要采用液相色谱。b) 按固定相的形状分：液相色谱又分为纸色谱、薄层色谱和柱色谱。纸色谱和薄层色谱多用于分析目的，而柱色谱用于大量制备(也可用于分析，如 HPLC)c) 按使用压力分：低压(0.5MPa)、中压(0.5-4.0MPa)、高压(4.0-40MPa)。高压液相色谱主要用于分析。d) 按流体流动方向分：轴向和径向色谱。一般的色谱操作中流动相从固定床的一端输入，沿轴流向另一端，属于轴向色谱；而沿径向流动属于径向色谱。e) 按分离操作方式分：洗脱展开、迎头分析、置换展开f) 按分配机理分：凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色
35、谱、疏水性相与作用色谱、亲和色谱3. 什么是平衡模型？理论板模型？1 平衡模型假定整个色谱柱中不存在传质阻力，溶质在固定相和流动相中的分配平衡均瞬间完成，即在色谱柱内的任何时刻和位置，固定相和流动相中的溶质浓度(分别为 cs 和 cm)均符合分配(吸附)等温式2 理论板模型认为溶质的分配平衡不能瞬间完成，而需要一定的柱高，即在此柱高内溶质在两相间达到一次平衡。4. 由 van deemeter 方程分析流动相流速与 HETP 的关系5. 什么是分离度？分离度与理论板数及容量因子有何关系？分离度是两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值之比。6. 分析凝胶过滤色谱的原理凝胶过滤色谱又称尺寸
36、排阻色谱，它是利用凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法7. 影响凝胶过滤色谱分离特性的因素有哪些？为什么？a) 线速度i. 除 NaCl 外，HETP 与线速度 u 基本上呈线性关系b) 料液体积i. 在一定的料液体积范围内 HETP 为常数，之后 HETP 随料液体积增大而急剧增大；ii. 料液浓度1. 根据 GFC 的分离原理，溶质的洗脱时间和 HETP 应与料液浓度无关；2. 但在实际操作中，当料液浓度较高时，洗脱曲线常呈现不对称形状，如出现吐舌或拖尾，甚至出现分裂的两个峰，使HETP 急剧增大；3. 料液与流动相的黏度比需小于 2，以避免不规则洗脱曲线
37、的出现，影响分离效果。c) 相对分子质量与分配系数的关系i. GFC 中溶质的分配系数在分级范围内随相对分子质量的对数值增大而线性减小；ii. 凝胶的分级范围越小，分离度越大；iii. 根据混合物中相对分子质量选择分级范围较小的凝胶过滤介质，对提高分离度或料液处理量是非常重要的。d) 凝胶颗粒i. 凝胶粒径越小，HETP 越小；ii. 减小粒径，不仅柱效增大，分离度提高，而且可以提高分离速度，即提高流速；iii. 通常在固定相或设备允许的压力范围内采用最大限度的流速，使柱效保持在较高的水平，提高分离度。8. 什么是离子交换色谱？与离子交换吸附有何关系？IEC 以离子交换树脂作为固定相，选择合适
38、的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法9. 离子交换色谱的恒定洗脱、线性洗脱及逐次洗脱各有何不同？1. 恒定洗脱 洗脱液(盐溶液或缓冲液)的流速和浓度均不发生变化。这种洗脱方法适用于样品纯度比较高，洗脱方便的情况2. 线性梯度洗脱 连续改变洗脱液(离子强度)的组成可使目标物洗脱集中，避免拖尾出现；并能提高分辩率，与其它成分洗脱分开；需要梯度洗脱设备。3. 逐次洗脱(介于恒定洗脱和线性洗脱之间)当样品含杂质较多时，可先用一种洗脱缓冲液洗脱杂质；然后用更强烈的(离子强度更高)洗脱液洗脱。a) 线性梯度洗脱法的优缺点i. 优点：流动相离子强度(盐浓度)连续增大，不出现干扰
39、峰，操作范围广；ii. 缺点：需要特殊的调配浓度梯度的设备。b) 逐次洗脱法(介于恒定洗脱和线性梯度之间)i. 优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便；ii. 缺点：因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰，而且易出现洗脱峰重叠，洗脱操作参数的设计较困难。10. 疏水性色谱的工作原理a) 亲水性蛋白质表面均含有一定量的疏水性基团，疏水性氨基酸含量较多的蛋白质疏水性基团多，疏水性也大；b) 利用表面偶联弱疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱法；c) 在离子强度较高的溶液中
40、，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，裸露出疏水部位，疏水性相互作用增大。d) 因此，HIC 蛋白质的吸附需要在高浓度盐溶液中进行，洗脱则主要采用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或逐次洗脱法。11. 什么是色谱聚焦？图示说明色谱聚焦的分离过程a) 色谱聚焦是基于离子交换的原理，根据两性电解质分子间等电点的差别进行分离纯化的洗脱色谱法.i. 准备：设有 A、B 两种蛋白质，等电点分别为 pIA 和 pIB,并且pIA pIB，首先用 pH 高于 pIA 的缓冲液冲洗色谱柱，使柱内pH 为 pH0；ii. 吸附：将一定量的料液加入上述色谱柱中，由于 pH0 pIA pIB，因此两种蛋白质均带负电荷
41、，被阴离子交换剂吸附；iii. 洗脱：用已将 pH 调到小于 pIB 的多缓冲剂为流动相进行洗脱，使柱内形成 pH 梯度；12. 什么是反相色谱？为什么对生物大分子大多采用反相色谱？反相色谱利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行分离纯化的洗脱色谱法；13. 羟基磷灰石色谱的工作原理是什么？a) 羟基磷灰石是一种磷酸钙晶体，基本分子结构为：Ca10(PO4)6(OH)2，在生物医学材料上有广泛应用；b) 在 HAP 晶面存在两种不同的吸附晶面，各存在吸附点 C 和 P，前者起阴离子交换作用，后者起阳离子交换作用；c) 在中性 pH 环境下
42、，酸性蛋白质(pI7)主要吸附于 P 点，可用磷酸盐缓冲溶液为流动相进行洗脱展开；d) 同样可采用线性梯度洗脱法。14. 什么是纸色谱和薄层色谱？有何应用纸色谱：以滤纸为介质，将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹。薄层色谱：将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析15. 什么是置换色谱？第 8 章 亲和色谱1、什么是亲和作用？什么是亲和色谱？生物亲和作用 生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这
43、种识别并结合的能力具有排他性即生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生物分子间的这种持异性相互作用称为生物亲和作用亲和色谱利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。2、为什么说亲和作用是自然界普遍存在的现象？生物分子间的亲和作用有何特点？3、影响亲和作用的因素有哪些？1) 离子强度a) 提高离子强度使静电引力降低b) 提高离子强度使氢键作用降低或消除c) 提高离子强度使疏水相互作用增强2pH 值 pH 将影响蛋白质的解离。因此，如果静电引力对亲和作用的贡献较大，则 pH 变化将严重影响亲和作用3 抑制氢键生成的物质i. 脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形
44、成ii. 但脲和盐酸胍高浓度下(4mol/L)下容易引起蛋白质的变性4 温度iii. 升高温度使静电作用、氢键及金属配位键减弱iv. 但升高温度使疏水性相互作用增强5 离液离子v. 半径较大的离液离子 SCN-、I-等使疏水作用降低6 螯合剂vi. 加入乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂除去金属离子，会使亲和结合作用消失4、简述亲和色谱操作过程5、亲和色谱有哪些种类的配基？1) 酶的抑制剂： 蛋白酶均存在抑制其活性的物质，这类物质称为酶的抑制剂。在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶的损害。2) 抗体： 利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色
45、谱。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力。但价格很贵，只适用于产量较小的某些基因工程药物。3) A 蛋白： A 蛋白分子量约 42000，与动物免疫球蛋白具有很强的亲和作用，可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。4) 凝集素 ：是与糖特异性结合的蛋白质(酶和抗体除外 )的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。5) 辅酶和磷酸腺苷：各种脱氢酶和激酶需要在辅酶的存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。磷酸腺苷的腺苷部分与辅酶的结构类似。6) 色素配基： 三嗪色素与 DNA 的结合，与蛋白质的结合7) 过渡金属离子： 过渡金属
46、离子可与 N、S 和 O 等供电子原子产生配位健，因此可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基等发生亲和结合作用；也可能形成螯合物8) 组氨酸： 具有弱疏水性，可与蛋白质发生亲和作用9) 肝素6、在配基和载体之间引入间隔臂的作用是什么？1. 间隔臂的存在能够排除由多孔基质的骨架引起的空间障碍，增加活性功能团（配基）的可动性，从而提高功能基团的利用率；2. 间隔臂的存在可以确保基质的惰性性质，而基质惰性性质正是色谱固定相能够具有生物特异性吸附、提高分辨率的重要条件；3. 间隔臂本身与蛋白质表面某一对应疏水区域相互作用，增加了对蛋白质的吸附能力。7、亲和膜色谱的原理是什么？利用亲和配基修饰的
47、微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质。亲和膜色谱的优点无内扩散传质阻力，仅存在表面液膜传质阻力，由于传质阻力小，吸附速度快，达到吸附平衡所需时间短，配基利用率高；设备压降小，流速快，设备体积小，配基用量低；微孔膜介质种类多，价格便宜。第九章 电泳1、什么是电泳？什么是电色谱？2、负电离子的双电层理论3、荷电溶质的泳动速度如何计算？4、什么是凝胶电泳？5、等电点聚焦的原理是什么？1) 分离原理(与色谱聚焦有相似之处)a) 一般的区带电泳利用溶质迁移率的差别进行分离，而等电点聚焦利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的 pH 值下呈电中性，不发生泳动的特点进行分离；b) 在电泳设备中
48、首先调配连续的 pH 梯度，然后使蛋白质在电场作用下泳动到等于各自等电点的 pH 值区域，从而形成具有不同等电点的 pH 值区域，从而形成具有不同等电点的蛋白质区带；c) 根据建立 pH 梯度的原理不同，梯度又分为载体两性电解质梯度（Carrier ampholytes pH gradient）和固相梯度。6、什么是二维电泳？同时利用分子尺寸和等电点这两种性质的差别进行蛋白质等生物大分子的分离，即将普通的凝胶电泳和等电聚焦相结合，使溶质在二维平面上得到分离。第一相 等电聚焦 第二相 SDSPAGE7、逆向作用色谱电泳的原理是什么？1) 凝胶柱分为上下两层；2) 利用填充两层具有不同排阻极限的凝
49、胶过滤介质的色谱柱为电泳场；3) 溶质的电泳速度方向与流动相的流向相反；上层色谱速度 RF,T 大于下层色谱速度 RF,B，电泳速度为 RE4) 在上层凝胶柱中，目标溶质的净速度 RN,T= RF,T- RE ,下层中的净速度RN,B= RF,B- RE ,方向相反；5) 当 RN,T=- RN,B 时，目标溶质在两层凝胶柱的交界处所受作用力达到动态平衡，从而积聚在界面处，产生界面聚焦现象，实现目标溶质的浓缩；6) 由于其它溶质的电泳迁移率以及在上下凝胶柱的色谱速度与目标溶质不同，不能在同一界面聚焦，从而实现目标溶质的浓缩和纯化8、毛细管电泳的原理及特点1) 分离原理a) 在电场中，毛细管内的电解质溶质因其荷电性质而发生电泳；b) 同时，在溶液中，石英毛细管内表面的硅羟基解离而带负电荷，诱导管内产生电渗流(EOF)；c) 溶质的移动速度是电渗流和电泳的综合结果。9、连续电泳的工作原理
