1、 For Research Use Only碧波 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)（通用型，适用于细胞、组织样本）Cat Number： Specification：Store at: -20 for one year Expire date：MADE BY BIOBOX碧波 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)（通用型，适用于细胞、组织样本）一、产品简介TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒 (Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的 DAB 显色等
2、步骤，即可在普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。细胞在发生凋亡时，会激活一些 DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组 DNA。细胞凋亡时抽提DNA 进行电泳检测，可以发现 180-200bp 的 DNA ladder。基因组 DNA 断裂时，暴露的 3-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的 dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的 Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在 HRP 的催化下通过 DAB
3、 显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA的断裂，因而没有 3-OH 形成，很少能够被标记。这就是 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。本试剂盒有如下优点：1、 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有 DNA 断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。2、 操作简便：使用 Ready-to-Use 型试剂，并配有 Proteinase K 和 DAB。3、 特
4、异性：TUNEL 检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。4、 快速：仅需约 3 个小时即可完成。5、 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。6、 方便观察：使用光学显微镜观察实验结果，无需贵重设备。二、试剂盒组份组 份 Cat: BA2020 Cat: BA2050 Cat: BA20100 储存条件平衡液 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20TdT 酶 80L 200L 400L -2050蛋白酶 K 40L 100L 200L -20Streptavidin-HRP 10L 25L 50L 4避光Bi
5、otin-dUTP 20L 50L 100L -20DAB 2mg 5mg 10 mg -20避光三、试剂盒以外自备仪器和试剂二甲苯、多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H 2O2 、TritonX-100 、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等；盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、光学显微镜、37孵箱、移液器等。四、保存条件：-20保存，Streptavidin-HRP和 DAB需避光保存。五、注意事项：1、TUNEL 法特异性检测细胞凋亡时产生的 DNA 断裂，但不会检测出射线等诱导的 DNA 断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生 D
6、NA 断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。2、极少数细胞凋亡时没有 DNA 断裂，此时不适用 TUNEL 法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现 TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。4、因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心。5、为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。6、 TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。7、为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。8、DAB
7、为固体粉末，使用前加入 PBS 配制成 20DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。9、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。六、 操作规程A、 检测样本的预处理TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件，如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。1、 对于细胞样本a、 把准备好的细胞涂片或爬片自然晾干。b、 把晾干的样本浸入固定液，室温（15-25）固定15-60min。（固定液的配制：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鲜配制）c、 把固定
8、好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min 。d、 把c 步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25 ）封闭10min。 （封闭液的配制： 3%H2O2溶于无水甲醇）e、 把d步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min 。f、 把e 步处理好的样本浸入通透液中，冰上（2-8 ）促渗2min 。（通透液的配制：0.1%TritonX-100 溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）g、 然后转入B步骤标记和显色反应。注意事项：a、 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。b、 固定好的样本可以在-20的 70%乙醇中放置30分钟或过夜，以改善细胞的渗透性。c、
9、使用PBS漂洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。d、 固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制。2、 对于石蜡切片a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70% 乙醇2min） ）b、 把a 步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min 。c、 把b步处理好的样本加入蛋白酶K工作液， 21-37作用15-30min。（蛋白酶K工作液的配制：2L 50 蛋白酶 K98L PBS）d、 把c 步处理好的样本浸入PBS漂洗
10、3次，每次5min 。e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25）封闭10min。（封闭液的配制： 3%H2O2溶于甲醇）f、 把e 步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min 。g、 然后转入B步骤标记和显色反应。注意事项：a、 蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而有所不同，需要自已摸索优化上述条件，如有问题，请根椐本说明书的常见问题的原因及推荐解决方案来调整条件。例如：如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400g/mL ）处理5分钟。 （本试剂盒的50Proteinase K浓度为1mg/mL） 。b、 其它替代方法： 石蜡
11、切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：替代方法1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于HCl PH2；胰蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5% 溶于0.01N HCl ）替代方法3: 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理 5 min。为防止
12、样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。c、 使用酶处理切片时一定要把酶洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。3、 对于冷冻切片a、 把冰冻切片浸入固定液，室温（15-25）固定30min 。（固定液的配制：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鲜配制）b、 把a 步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次15min 。c、 把b步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25）封闭10min。（封闭液的配制： 3%H2O2溶于甲醇）d、 把c 步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min 。e、 把d步处理好的样本浸入通透液中，冰上（2-8）促渗2min（通透液
13、的配制：0.1%TritonX-100 溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）f、 然后转入B步骤标记和显色反应。4、对于难处理的切片a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合（如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70% 乙醇2min） ）b、 把a 步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min 。c、 把b步处理好的样本加入浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中750W（高档）处理1 min。d、 迅速加入80ml双蒸水（20-25）加入c步处理好切片的塑料盒中，冷却至
14、室温， 将组织切片转移至PBS（20-25）中。e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25）封闭10min。（封闭液的配制： 0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清）f、 把e 步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次10min 。g、 然后转入B步骤标记和显色反应。5、 阳性对照及阴性对照的准备TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。a、 阳性对照样本的准备样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，细胞样本在Triton X-100 通透液处理、PBS浸
15、洗后，再加入100L DNase I反应液（用户自备）室温37处理10 -30 min，其余步骤均相同。（DNase I反应液的配制：10u-3000u DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2）b、 阴性对照样本的准备在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。B、 标记和显色反应：1、 预处理好的样本 PBS 漂洗 2 次，每次 5min 后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。2、 配制 TdT 酶反应液：参考下表配制适当量的 TdT 酶反应液（根据需要按照比例放大） ，需充分混匀。注意：配制好的 T
16、dT酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。1个样品 5个样品 10个样品平衡液 45l 225l 450lBiotin-dUTP 1l 5l 10lTdT 酶 4l 20l 40lTdT 酶反应液总体积 50l 250l 500l3、 每个样本滴加 50L TdT 酶反应液，加盖玻片 37避光湿润反应 60min。 （阴性对照片不加 TdT 酶）4、 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min 。5、 Streptavidin-HRP及DAB工作液的配制：Streptavidin-HRP工作液的配制：参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混匀。注意：配制好的S
17、treptavidin-HRP工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。1个样品 5个样品 10个样品Streptavidin-HRP 0.5l 2.5l 5lPBS 99.5l 497.5l 995lStreptavidin-HRP 工作液总体积 100l 500l 1000lDAB 工作液的配制：a、先把试剂盒中 DAB 粉末用 PBS 溶解配制成 20DAB（10 mg/ml） ，配制方法如下：DAB 2mg 5mg 10mgPBS 0.2ml 0.5ml 1.0ml配制成 20DAB（10 mg/ml） ，放于-20保存b、DAB 工作液的配制：参考下表配制适量的DAB工作液，需充分混匀。注意
18、：配制好的DAB工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。1个样品 5个样品 10个样品20DAB（10 mg/ml） 5l 25l 50l30H 2O2 1l 5l 10lPBS 94l 470l 940DAB 工作液总体积 100l 500l 1000l6、 将第5步处理好的样本周围用滤纸或吸水纸吸干，再滴加50L Streptavidin-HRP 工作液，加盖玻片37湿润避光反应30min。7、 把第6步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min ，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。8、 将第7步处理好的样本滴加50L-100L DAB工作液，室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间。注意：如
19、果显色很强可以短于5分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。9、 把第8步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min ，可直接光学显微镜下观察、拍照。10、 选做(本步骤可不做)：用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色。随后用 PBS漂洗3次，每次5min，光学显微镜下观察、拍照。操作注意事项：1、 PBS 清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去 PBS 溶液后再进行下一步反应。2、 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。3、 TdT 酶反应液即用即配
20、，短暂于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。4、 如果 20DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。5、 苏木素复染：将切片放入苏木素染液，染色 30min ，蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中 5s，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用 70%、85%、95%、无水乙醇浸泡5min。用二甲苯浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。七、常见问题的原因及推荐解决方案.现象 可能原因 建议TdT 酶的浓度过高 用 TdT dilution buffer* 作 12110 稀释TdT 酶反应时间过长或 TdT 酶反应过程中反应液渗漏，细胞
21、或组织表面不能保持湿润。注意控制反应时间，并确保 TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本 DNA 的断裂）尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂在固定组织时样本 DNA 已断裂（内源核酸酶的作用）确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液 采用推荐的固定液非特异性染色固定后某些核酸酶活性依然较高导致 DNA 断裂 用含有 dUTP 和 dAPT 的溶液封闭如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失）用溶于 PBS PH7.4 中的 4%多聚甲醛固定或福尔马林或
22、戊二醛固定。固定时间过长，导致交联程度过高 减少固定时间，或用溶于 PBS PH7.4 的 2%多聚甲醛固定荧光淬灭 Fluorescence 在普通光照 10 分钟就会严重淬灭，需注意避光操作促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低1、 增加通透剂促渗时间2、增加通透剂的作用温度（15-25）3、优化蛋白酶 K 的作用浓度和作用时间（如：以 400ug/ml 作用 5min）4、0.1M 的柠檬酸钠 70作用 30min。标记率低选择的染料不合适 用溶于0.1M醋酸巴比妥的3-5%甲基绿PH4.0，或苏木素复染支原体污染 请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染TdT 酶的浓度
23、过高或反应时间过长 用 TdT dilution buffer* 作 12110 稀释或注意控制反应时间红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。 宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的 DNA 断裂。在非高增殖期取样检测DAB 孵育时间过长 减少 DAB 染色时间染色背景很高Biotin-dUTP 的非特异性结合 在 TdT 酶反应之后，再用含 0.1% Triton X-100 和 1 mg/ml BSA 的 PBS 洗三次。阳性对照没有信号 DNase I 的浓度过低1、 冷冻切片使用3u/ml的DNase I2、 石蜡切片使用 1500u/ml的DNase I 3、 一般样本使用10u/ml DNase I组织样本从载玻片脱落组织样本被酶从玻片消化下来 降低蛋白酶 K 的处理时间*TdT dilution buffer：100mM乙酸钾（ pH6.8）， 1 mM 2-mercaptoethanol ， 50 % Glycerol
