第三章 高效液相色谱法09--仪器分析.ppt

1、第三章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC),31 高效液相色谱法的特点一、概述高效液相色谱法（HPLC）是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进。目前已成为应用极为广泛的化学分离分析重要手段。例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。,70年代迅速发展80年代以来HPLC文献量 21%（89年）仪器销售量 25%（12 亿）（89年）应用领域 拓展（化工、环保、临床、药品、生命）超过 GC,HPLC的特点：,“三高

2、” “一快” “一广”,高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,2流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力

3、 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用,3操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,32 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素,气相色谱所讨论的基本概念及基本理论,如:保留 值，分配系数，分配比，分离度，塔板理论，速率理 论等与液相色谱一致，但液相色谱流动相为液体，其 扩散系数，粘度，密度等与气体均有很大的差别，都 将对色谱分析过程产生影响。,该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。,（一）HPLC中的速率理论,涡流扩散 A=2dp 球形、小粒度、均匀（RSD5%

4、）固定相，匀浆高压填充，以降低A。 纵向扩散 B=2Dm 可以忽略。 因为Dl很小，室温操作，且u大于u最佳,2、液相色谱传质阻力：,（2）流动相传质阻力项,（3）流动相滞留传质阻力项,（1）固定相传质阻力项 (df极小),(二) HPLC法中提高分离效率的措施,1. 固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，1mL/min 3. 柱温的选择：选室温250C左右,33 高效液相色谱法的类型 及其分离原理,液液分配色谱 （LLPC） 化学键合相色谱(CBPC) 液固吸附色谱(LSAC

5、) 离子交换色谱(IEC) 离子对色谱(IPC) 离子色谱(IC) 尺寸排阻色谱(SEC)(凝胶色谱法 Gel C) 亲和色谱(AC),高 效 液 相 色 谱 法 类 型,（）液液分配色谱法（LLPC）及化学键合相色谱(CBPC) 1分离原理分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。与气液色谱一样，固定液是涂渍在担体表面；与气液色谱的不同之处在于，液相色谱的流动相种类对分配系数有较大的影响。,2、正相分配色谱和反相分配色谱根据所用流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。 正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性。它适

6、用于极性化合物的分离。反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。,液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。,3、化学键合相色谱为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法，代替了固定液的机械涂布，它的分离机理：一般认为分配和吸附两种作用兼有。可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破，对液相色谱的迅速发展起着重大作用 。

7、它是目前应用最广泛的一种固定相。,键合固定相,非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（十八烷基键合硅胶）柱或C18柱就是最典型的代表，其极性很小。 极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。,二、吸附色谱（adsorption chromatography）原理：基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。固定相： 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。,流动相：

8、弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。,应用： 吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。,三、离子交换色谱 （ion exchange chromatography, IEC）IEC使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。,SO3H +

9、 M+,SO3M + H+,（四）离子色谱法（IC）,离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，因有些被测离子不能采用紫外检测器，若采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。,因此，就在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。,当试样经阳离子交换剂的分离柱后，随

10、流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应： R+OHH+Cl- R+Cl+H2OR+OH-M+Cl-M+OHR+Cl-由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理，也是水溶液中阴离子分析的最佳方法。,（五）离子对色谱法（IPC）,1分离原理离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。离子对形成机理：假如有一离子对色谱体系，固定

11、相为非极性键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子A-相反的离子B+，B+离子由于静电引力与带负电的组分离子生成疏水性离子对化合物A-B+。,由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对疏水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。,（六）尺寸排阻色谱法（SEC） （又称凝胶色谱和分子筛色谱）原理： 以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。,大分子全排出 小分子全

12、进入,尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后流出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。,(七)亲和色谱法（AC）简介,亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。它通常是在载体表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的

13、生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。,36 高效液相色谱仪,高效液相色谱仪的一般可分为个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统,检测系统和附属系统,其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,高效液相色谱仪,输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统,1高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。一般由储液罐、

14、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。,2进样系统,高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。进样装置：注射器进样；高压定量进样阀；,2、进样系统通常采用六通伐进样：,色谱柱

15、,色谱柱,泵,泵,1,2,进样,3、分离系统色谱柱,色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜，内衬光滑的聚合材料。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。,4检测系统,在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质型检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等

16、。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。,（l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电导检测器,（1）紫外-可见检测器,光源,检测室,光栅,二极管阵列检测器,5、 附属系统它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。梯度淋洗（梯度洗脱）：是在分离过程中逐渐改变流动相的组成，增加洗脱能力的一种方法。主要是通过梯度装置将两种（或更多）极性不同的溶剂在分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的的配比和极性。类似于气相色谱程序升温的作用。优点：通过改变极性来改变分离组分的分离因素，以提高分离效果，增加分辨能力，改善峰形，同时可缩短分离时间。,梯度洗脱装置通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的洗脱能力，其作用与气相色谱的程序升温类似。,A,B,A,B,C,C,右图表示用二元梯度来分离几种氨基甲酸酯类杀虫剂，采用15cm的C18柱，溶剂组成：CH3CN-H2O， 15分钟内从10%（V/V）随时间改变至50%,