1、嗜热四膜虫金属硫蛋白 MTT1 和 MTT2 的结构与功能分析【摘要】：金属硫蛋白(MTs)是细胞胞内金属结合蛋白超家族中的一员,几乎存在于所有生物体中,有较低的分子量(7000Da),分子内缺少芳香族氨基酸或组氨酸,并且能够通过半胱氨酸残基鳖合 Zn、Cu 或 Cd等金属离子以达到解毒的目的。在哺乳动物体内 MTs 维持铜离子的动态平衡和清除自由基。金属硫蛋白根据物种种类被分为 15 个家族,四膜虫金属硫蛋白属于第 7 亚家族。嗜热四膜虫是第一个完成全基因组测序的纤毛类原生动物。目前,从嗜热四膜虫全基因组数据库分析发现其有 5 种金属硫蛋白基因：MTT1、MTT2、MTT3、MTT4 和MT
2、T5,然而它们编码蛋白的生理功能仍不清楚。为了了解不同 MTs在四膜虫细胞内的功能,本课题以 MTT1 和 MTT2 为研究对象,首次对两种蛋白的结构和功能进行分析,获得结果如下：1MTT1 和 MTT2生物信息学分析 MTT1 基因编码 162 氨基酸的长链多肽,预测分子量为 16.76kDa；而 MTT2 基因编码 108 氨基酸,预测分子量为11.17kDa,他们的分子量显著地高于其它高等真核生物。在 Cys 的排布模式上两者存在显著差别：MTT1 主要包括 Cys-Cys-Cys(CCC)和Cys-Cys(CC)结构,Cys 排布方式与哺乳动物金属硫蛋白的 a-domain相似；MTT
3、2 主要包括 Cys-X-Cys(CXC)结构,Cys 排布方式与哺乳动物金属硫蛋白的(3-domain 相似。2MTT1 和 MTT2 的表达分析通过实时定量 PCR 的方法分析了 MTT1 和 MTT2 在细胞对数生长期的表达,发现 MTT2 的表达量约是 MTT1 的 32 倍。同时观察了铜、镉、S02 衍生物、高盐 (NaCl)和饥饿初期等条件下二者表达的差异,MTT1能够被多种诱导物有效诱导表达,而 MTT2 对铜离子敏感。3MTT1和 MTT2 基因的克隆、突变和蛋白表达纯化通过 PCR 从四膜虫大核基因组克隆到 MTT1 和 MTT2 基因,通过定点突变将 MTT1 分子中的TA
4、A 和 TAG 突变为 CAA 和 CAG,同时将 MTT1 和 MTT2 基因的 N端突变：V4W(MTT1)和 T3W(MTT2),然后将 MTT1 和 MTT2 连接pET28a 表达载体构建重组表达质粒 pET28a-MTT1 和 pET28a-MTT2,分别转化 E.coliBL21(DE3)后经过 1mMIPTG 诱导表达,获得了 MTT1和 MTT2 蛋白的包涵体,约占总蛋白的 15-35%,包涵体溶解后经 Ni2+亲和层析柱和 Superdex75 凝胶层析柱纯化得到目的蛋白。4MTT1和 MTT2 蛋白的分析利用荧光光谱研究 MTT1 和 MTT2 蛋白与二价重金属离子结合的
5、特征发现,MTT1 可以结合 16 个镉离子,MTT2 可以结合 11 个镉离子；圆二色谱(CD)分析发现,MTs 分子中半胱氨酸残基的排布形式影响着 MTs 与金属离子结合后的二级结构,带有独特“CCC”簇的 MTT1 和“CXC”簇的 MTT2 在结合镉离子之前二者蛋白质二级结构类似,均以无规则卷曲为主,而结合镉离子后 Cd16-MTT1复合物中 -螺旋和 -转角占据优势,而 Cd11-MTT2 复合物却依然以无规则卷曲为主。5Cd16-MTT1 和 Cd11-MTT2 的抗氧化能力将1mM 的 Cd16-MTT1 和 Cd11-MTT2 复合物与低浓度 NO(0.5mM)反应,经过傅里叶
6、红外光谱扫描发现,有二硫键形成,证实了 Cd16-MTT1和 Cd11-MTT2 复合物均具有抗氧化能力。6MTT1 和 MTT2 的鳌合重金属能力利用紫外-可见光光谱对 MTT1 和 MTT2 结合第二副族(B) 重金属离子的稳定常数进行了分析,MTT1 和 Cd2+结合有最大的稳定常数(KCd-MTTI=1.451020.45),和 Hg2+结合的稳定常数次之(KHg-MTT1=2.471019.43),和 Zn2+结合的稳定常数最小(KZn-MTT1=1.411016.60)；MTT2 和 Cd2+、Hg2+、Zn2+ 的稳定常数分别为 KCd-MMT2=2.191018.10，KHg-
7、MTT2=8.46107.79,KZn-MTT2=1.411010.98.在 Cu2+滴定 Cd16-MTT1 和 Cd11-MTT2 复合物的过程中发现,Cu2+不能有效替换 Cd16-MTT1 复合物中的镉离子,而 Cu2+却能够置换 Cd11-MTT2 复合物中的镉离子。7 三价稀土元素 La3+对 MTT1 和 MTT2 的影响 La3+在低浓度时( 小于 80uM)能够促进嗜热四膜虫细胞繁殖,而高于这个浓度反而抑制细胞繁殖,超过100M 后细胞破裂死亡；同时荧光光谱实验证实 La3+可以进入四膜虫细胞；进入细胞内的 La3+能够诱导 MTTl 和 MTT2 的表达,但MTTl 的响应
8、倍数(25 倍)要高于 MTT2(5 倍)；荧光光谱实验也证实MTT1 和 MTT2 蛋白可以与 La3+发生结合反应以达到解除 La3+毒性的作用。8MTT1 和 MTT2 基因敲除细胞株的构建生物信息分析表明 MTT1 和 MTT3 串联排列,且 Cys 排列模式一致；MTT2 和 MTT4串联排列,Cys 排列模式一致。为分析 MTT1 和 MTT2 在体内的功能,通过同源重组,构建了MTT1-MTT3 和MTT2-MTT4 基因敲除细胞株。相对于野生型细胞株,MTT1-MTT3 基因敲除细胞株繁殖速度较快,且对 Cd2+更加敏感；而MTT2-MTT4 基因敲除细胞株繁殖速度变慢,对 C
9、u2+更加敏感。本研究首次对具有不同一级结构特征的长链金属硫蛋白 MTT1 和 MTT2 进行了体外表达、纯化和光谱分析,证实 MTT1 被多种环境因素诱导并对镉离子具有强的亲和力。而Cu2+能够高效地诱导 MTT2 的表达并能够置换 Cd11-MTT2 中的Cd2+。说明金属硫蛋白中“CCC” 簇与“CXC”簇的排布方式与离子结合存在一定的相关性,带“CCC” 簇的 MTT1 更偏爱 Cd2+,而 Cu2+偏爱结合富含“CXC” 簇的 MTT2。因此,带有独特“CCC”簇的 MTT1 更多参与重金属离子的解毒,而带有“CXC”簇的 MTT2 可能主要参与生物体内 Cu2+的代谢,进一步说明了
10、不同 MTs 在细胞中执行不同的生理功能。本研究也首次证实了三价稀土元素 La3+能促进四膜虫细胞繁殖,同时进入细胞并诱导 MTTl 和 MTT2 的表达 ,而 MTT1 和 MTT2也可能通过天冬氨酸或谷氨酸上的 O 原子与 La3+发生相互作用。MTTl 和 MTT2 基因敲除实验进一步表明：两种不同的金属硫蛋白执行不同的生物学功能。 【关键词】：金属硫蛋白嗜热四膜虫表达光谱分析稳定常数【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：Q75【目录】：中文摘要 10-13ABSTRACT13-16 缩略语表 16-17 第一章文献综述 17-341.1 金属
11、硫蛋白概述 17-201.1.1 金属硫蛋白的基本特征及分类 17-181.1.2 经典金属硫蛋白的结构与表达调控 18-201.2金属硫蛋白的生物学功能 20-221.2.1 参与体内微量元素代谢及拮抗重金属的毒性 201.2.2 清除自由基 20-211.2.3 参与各种胁迫反应211.2.4 金属硫蛋白和疾病的相关性 21-221.3 四膜虫金属硫蛋白研究进展 22-311.3.1 四膜虫金属硫蛋白概述 22-251.3.2 四膜虫金属硫蛋白的进化 25-271.3.3MTs 基因的表达调控 27-301.3.4MTs 的应用 30-311.4 本项研究的目的和意义 31-34 第二章嗜
12、热四膜虫金属硫蛋白的分析及 MTT1 和 MTT2 的克隆 34-482.1 材料 34-352.1.1 菌株及质粒342.1.2 试剂及酶 34-352.1.3 主要试剂配制 352.1.4 主要仪器设备352.2 方法 35-402.2.1 四膜虫细胞培养 35-362.2.2 四膜虫基因组的提取 362.2.3MTT1 和 MTT2 基因的克隆 36-402.3 结果 40-462.3.1MTs中 Cys 的分布特点 40-412.3.2 四膜虫 MTs 在染色体上的位置 41-422.3.3 嗜热四膜虫 MTs 不同时期的表达 42-432.3.4MTs 中半胱氨酸排布特点分析 43-
13、442.3.5MTT1 和 MTT2 基因的克隆 44-462.4 讨论46-48 第三章四膜虫金属硫蛋白 MTT1 和 MTT2 在不同胁迫条件下的表达分析 48-673.1 材料与仪器 48-493.1.1 细胞株 483.1.2 试剂及工具酶 483.1.3 主要仪器 48-493.1.4 主要试剂的配制 493.2 方法 49-523.2.1 四膜虫细胞培养 493.2.2SO_2 衍生物和 NaCl 对四膜虫繁殖的影响 493.2.3La(3+)对四膜虫繁殖的影响 493.2.4La(3+)进入嗜热四膜虫细胞实验 493.2.5 胁迫条件对四膜虫的处理 49-503.2.6 总 RN
14、A的提取 50-513.2.7cDNA 合成 513.2.8RealtimePCR 引物设计 51-523.2.9 基因表达分析 523.3 结果 52-643.3.1NaCl 对嗜热四膜虫繁殖速度的影响 52-533.3.2SO_2 衍生物对嗜热四膜虫繁殖速度的影响53-543.3.3La(3+)对嗜热四膜虫繁殖的影响 543.3.4La(3+)能够进入四膜虫细胞 54-563.3.5 对数生长期金属硫蛋白 MTT1 和 MTT2 的表达 56-593.3.6Cd(2+)和 Cu(2+)对金属硫蛋白 MTT1 和 MTT2 表达的影响 59-603.3.7NaCl 对金属硫蛋白 MTT1 和
15、 MTT2 表达的影响60-613.3.8 短期饥饿对嗜热四膜虫 MTT1 和 MTT2 表达影响 61-623.3.9SO_2 衍生物对 MTT1 和 MTT2 表达的影响 62-633.3.10La(3+)对嗜热四膜虫 MTT1 和 MTT2 的影响 63-643.4 讨论64-67 第四章四膜虫金属硫蛋白 MTT1 和 MTT2 的功能比较 67-894.1材料 67-694.1.1 菌株及质粒 674.1.2 试剂及酶 67-684.1.3 主要试剂配制 68-694.1.4 主要仪器设备 694.2 方法 69-754.2.1pET28a-MTT1 和pET28a-MTT2 表达质粒
16、的构建 69-704.2.2 重组表达质粒 pET28a-MTT1 和 pET28a-MTT2 的鉴定 704.2.3MTT1 和 MTT2 的表达 70-714.2.4MTT1 和 MTT2 的纯化 71-734.2.5MTT1 和 MTT2 的荧光光谱分析 734.2.6Cd_(16)-MTT1 和 Cd_(11)-MTT2 的圆二色谱(CD) 光谱分析 73-744.2.7Cd_(16)-MTT1 和 Cd_(11)-MTT2 抗氧化能力分析744.2.8MTT1 和 MTT2 与B 金属离子稳定常数测定 744.2.9Cd_(16)-MTT1 和 Cd_(11)-MTT2 与 Cu(2
17、+)的反应 74-754.2.10MTT1 和MTT2 蛋白与 La(3+)作用的荧光分析 754.3 结果 75-874.3.1pET28a-MTT1 和 pET28a-MTT2 表达质粒的构建 754.3.2MTT1 和 MTT2 基因的诱导表达纯化 75-774.3.3MTT1 和 MTT2 蛋白的纯化 77-794.3.4MTT1 和 MTT2 结合 Cd(2+)的数目 79-804.3.5Cd_(16)-MTT1和 Cd_(11)-MTT2 的二级结构分析 80-814.3.6Cd_(16)-MTT1andCd_(11)-MTT2 的抗氧化能力 81-824.3.7MTT1 和 MT
18、T2 结合 Cd(2+),Hg(2+)和 Zn(2+)的稳定常数 82-844.3.8Cd_(16)-MTT1和 Cd_(11)-MTT2 与 Cu(2+)反应的动态分析 84-864.3.9La(3+)与MTT1 和 MTT2 相互作用研究 86-874.4 讨论 87-89 第五章 MTT1 和MTT2 基因敲除细胞株的构建和鉴定 89-1015.1 材料与仪器 89-905.1.1 细胞株、菌株和质粒 895.1.2 试剂及工具酶 895.1.3 主要仪器895.1.4 主要试剂的配制 89-905.2 方法 90-945.2.1MTT1 和 MTT3 基因侧翼序列的克隆 90-915.
19、2.2MTT1 和 MTT3 基因敲除载体的构建91-925.2.3MTT2 和 MTT4 敲除载体的构建 925.2.4MTT1-MTT3 和MTT2-MTT4 嗜热四膜虫敲除株的构建 92-945.2.5Cd(2+)与Cu(2+)对四膜虫敲除株繁殖的影响 945.3 结果 94-995.3.1MTT1 和MTT3 及 MTT2 和 MTT4 侧翼序列的克隆 94-955.3.2 敲除载体pNEO4-MTT1-MTT3 和 pNEO4-MTT2-MTT4 的构建 95-965.3.3MTT1-MTT3 和MTT2-MTT4 细胞株的鉴定 96-985.3.4 不同条件下三种细胞株繁殖的比较 98-995.4 讨论 99-101 总结 101-103 展望 103-104 参考文献 104-121 攻读学位期间取得的研究成果 121-122 致谢122-123 个人简况及联系方式 123-125 本论文购买请联系页眉网站。
