1、硫醇光学探针摘要：细胞内的生物硫醇，通过自由硫醇(RSH)和氧化二硫化物(RSSR)的平衡在维持生物氧化还原动态平衡中起着关键作用，定量检测生物体系中硫醇的浓度在生物化学和临床化学中具有重要意义。通过改变颜色或荧光强度（或发射波长）检测的硫醇光学传感器在过去的十年吸引了相当多的关注，一些优秀的荧光和比色传感器被设计，并且成功应用于生物样品检测和细胞成像。本文对过去十年内的硫醇光学传感器进行了综述，并展望了此类探针的发展趋势和应用前景。1 引言细胞内的生物硫醇，例如谷胱甘肽（GSH）,同型半胱氨酸（Hcy），和半胱氨酸（Cys），通过自由硫醇(RSH)和氧化二硫化物(RSSR)的平衡在维持生物氧
2、化还原动态平衡中起着关键作用 1。然而异常的半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽水平，与一些疾病密切相关，如肝脏损伤、皮肤损伤、生长缓慢、水肿，痴呆、老年痴呆症、冠心病、颈动脉粥样硬化、肌张力障碍、牛皮癣、临床打击，肺损伤、帕金森症、和哮喘，白血球降低、癌症、艾滋病。硫醇也活跃在酶的催化位点，在代谢途径扮演重要角色。因此，定量检测生物体系中硫醇的浓度在生物化学和临床化学中具有重要意义。 2-3目前已报道的检测方法有：高效液相色谱法、毛细管电泳法、质谱法等。然而这些方法需要复杂、耗时的步骤、使用高级昂贵的仪器和高的检测限。通过改变颜色或荧光强度（或发射波长）检测的硫醇光学传感器由于它们简单、便宜和检
3、测迅速，在过去的十年被广泛研究。近期，Yin等对硫醇荧光探针进行了综述 2。虽然近几年，一些硫醇比色传感器被报道，但硫醇比色传感器还没有被评论。本文按光学传感器与巯基作用机理的不同进行分类，对近十年该领域的研究进展进行评述。硫醇巯基强的亲核性，与软酸强的配位能力，利用巯基断裂硒氮键、断裂磺酸脂键、断裂磺酰胺键，含氮末端硫醇与醛基反应，对缺电子双键的亲核加成，与方酸衍生物缺电子四元环加成等作用机理被应用于硫醇光学传感器设计。本文按照上述硫醇与传感器作用机理进行分类，对对近十年该领域的研究进展进行了评述。一些机理如光致诱导电子转移（PET）、荧光共振能量转移（RET）、分子内电荷转移（ICT）等也
4、被应用与硫醇光学传感器设计研究，本文也对其进行了简要概述。2 利用巯基与二硫键的氧化还原平衡反应检测硫醇的光学探针生物体内存在巯基与二硫键的氧化还原平衡，因此巯基与二硫键作用被用于设计硫醇光学探针。此类探针不改变细胞内的总硫醇含量，有较低的氧化还原电势等优点，被广泛应用于荧光显微成像。（1）断裂二硫键检测硫醇含量应用最广泛的试剂是 Ellmans 试剂（1）。由于跨膜电荷排斥和基于吸光率的检测方法不能应用于细胞内的检测，因此这种试剂只能应用于体外。Zhu 等在 2004 年报道了 5-（2-氨乙基）二硫-2 硝基苯甲酸盐（2）作为Ellmans 试剂的替代物 4。2 与自由硫醇的反应在动力学上
5、与 Ellmans 试剂相似，但在碱性条件下更稳定，能应用于碱性条件下硫醇含量和酶活性的检测。SHOCO2N COHNO21O2CO2N S NH22Pires 等报道了一种含有两个双硫键的罗丹明 110 衍生物作为硫醇的荧光探针（3） 5.探针本身无荧光，当 3 的双硫键被溶液中的硫醇或细胞内的谷胱甘肽还原时暴露出亲核的巯基，暴露的巯基导致邻近的氨基甲酸键断裂，因此释放出具有强烈荧光的罗丹明 110。探针被应用于 HeLa 细胞激光共振聚焦成像。OONHHN ONH2H2NOSH3N OSNH3OONHHNOSHOHS O3Lee等近期发表了利用双光子荧光探针4 6。该探针有二硫键作为硫醇的
6、反应位点，以2-氨甲基-6-乙酰基萘作为显色团，用双光子显微镜法能够在组织90180m深度活体细胞核和活体组织检测硫醇。该探针被应用于HeLa细胞成像和老鼠海马趾的薄片成像。可对细胞内硫醇浓度的变化产生响应。O NOOS NH34（2）基于荧光共振能量转移的二硫键硫醇荧光探针（DSSA）荧光共振能量转移（FRET）是一种从供体荧光团的激发态到供体100 内适当的受体荧光团的能量非辐射量子机械转移。基于荧光共振能量转移的二硫键硫醇荧光探针（DSSA）由含二硫键（SS）的链联接供体(D)和受体(A)组成。由于受体和供体之间的荧光共振能量转移，使此类探针显示较弱的荧光。当体系中存在硫醇时，硫醇通过反
7、应断裂二硫键，从而使供体和受体分离，导致荧光共振能量转移减小，供体产生较强的荧光。通过检测供体的荧光，可实现对硫醇的检测和谷胱甘肽还原酶活性的检测。此类检测相对于普通的荧光检测有更高的灵敏度和更小的背景干扰。但反应时间较长，不利于硫醇的即时检测。Piggott和Karuso通过一个短的含二硫键的链连接两分子荧光素组成了一个新的荧光探针5 7。5的能量最小模型显示：当含二硫键的链完全伸展时两个荧光团的距离低于30 ，小于荧光素44的Forster 半径，因此分子显示出强的荧光共振能量转移（FRET）间接猝灭。硫醇断裂二硫键使两个荧光素分子分离，导致荧光共振能量转移（FRET）间接猝灭减小和相应的
8、520nm荧光强度增大。探针被应用于检测GSH和谷胱甘肽还原酶的活性。 OOOHO OHNHONHS HNNHO OOOOOHO OH5Pullela等报道了另两种DSSA探针（6和7） 8，6和7由荧光素（D）通过二硫键联接罗丹明（R）组成。由于荧光素的发射光谱和罗丹明的激发光谱有效重叠，荧光素的荧光被猝灭。与硫醇反应后二硫键断裂，供体和受体荧光团分离，荧光素的荧光恢复，通过检测荧光素荧光强度的变化来检测硫醇弄浓度的变化。罗丹明在pH6.0时有荧光,因此探针5能在很宽的pH范围内有荧光。并且荧光素在pH 6.0自环化成中性的螺内酰胺，从而保证了5在不同pH值的细胞膜渗透性。因此5能够在很宽的
9、pH范围内标记细胞内的硫醇。OEt2N NEt2OHN S HNHNSCOHO O6OEt2N NEt2ONHS HNHNS COOHO O7Wang等报道了基于荧光素-胱胺-甲基红的荧光探针8 9.该探针能在1M浓度范围内检测同型半胱氨酸。 OHO OHHOCHNNHS S NHONMe2N8Lee等报道了一个氧化还原电势探针9 10， 9由缩氨酸连接carbostyril和铽螯合物DTPA(Tb)组成。如图8所示，9有两种存在形态：氧化态和还原态。9的氧化态共轭发光，发光由激活发射产生（sensitized emission）。当carbostyril被激发，carbostyril的激发态
10、能量随后转移至Tb，然后激发态的Tb通过光散发回至基态。这种从显色团到金属离子有效的能量转移由距离决定。在氧化态中缩氨酸中的两个巯基以二硫键形式存在，carbostyril在封闭的空间接近铽螯合物，允许产生激活发射（sensitized emission）。当探针处于还原态，探针采取随意的卷式构象，在空间上分离发色团和铽螯合物，限制了激活发射过程。探针的氧化态（强荧光）和还原态（弱荧光）之间的不同的荧光能被用来测量环境的氧化还原电势。3 利用巯基对缺电子芳环的亲核取代反应（ArS N）Jiang 等利用荧光团 NBD-Cl 设计合成了一个利用磺酰胺检测硫醇的荧光探针 1011,由于烷基硫醇与苯
11、基硫酚 pKa 的不同(分别为 8. 5 和 6. 5) ,在中性条件下烷基硫醇几乎不能电离而苯基硫酚能够大部分电离,电离出的巯基负离子的亲核性远大于巯基。因此,该探针在中性条件下可以选择性的检测苯基硫酚,烷基硫醇不干扰。探针 10 由于分子内电子转移( ICT)使母体荧光团的荧光被猝灭。由于苯基硫酚中性条件下电离出的巯基负离子具有强亲核性,与 2, 4-二硝基苯发生 ArS+反应使磺酰胺键断裂,ICT 受阻荧光恢复。该探针灵敏度高(与苯基硫酚反应可产生 50 倍的荧光增强) ,选择性好(半胱氨酸、谷胱甘肽、烷基硫醇以及其它具有亲核性的胺、氰根等不干扰测定) ,条件温和(室温下 pH 7. 3
12、 磷酸盐缓冲溶液中 10 min 反应基本完成) ,是第一个可以选择性的检测苯基硫酚而烷基硫醇不干扰的荧光探针。由于苯基硫酚是一类高毒性的环境污染物,在石油和煤的精炼厂、橡胶和塑料工业中都会产生大量的苯硫酚污染物,因此能够选择性的检测高毒性的苯基硫酚在环境科学中具有重要意义。Bouffard 等开发了一个红色的荧光增强型的磺酰胺荧光探针 1112,由于 ICT过程探针分子本身的荧光很弱,与硫醇反应后磺酰胺键断裂,吸收光谱红移 158 nm,荧光增强 120 倍。探针成功用于小鼠胚胎纤维原细胞成像,由于探针的发射波长位于近红外区(623 nm) ,该探针具有在小动物的活体内成像的潜能。探针缺点在
13、于本体荧光团在水溶液中的荧光量子产率非常低,仅为 0. 01。该方法通过加入 1%人血清蛋白将其荧光量子产率提高到 0. 24。NONNHO2N SOO2NNO210 SO2O2NNO2N CNCNOCNOOMeO 1Shibata 等设计合成了一个罗丹明磺酰胺测硫醇的荧光探针 1213。该探针基于罗丹明开环闭环结构的变化,探针本身无荧光,与硫醇类物质反应后磺酰胺键断裂,罗丹明 110 的强荧光结构恢复,荧光增强 5800 倍。探针 12 成功用于人乳腺癌细胞(HeLa cells)共聚焦成像,证明该探针膜渗透性好、可以对活细胞内硫醇浓度的变化产生响应。 OOOHN HNSOOO2NN2 SO
14、O2NNO212Ji 等报道了基于分子内电荷转移的关-开荧光硫醇探针 12 和 1314.由于作为供体的乙炔基 pyrene 荧光团和作为受体的磺酰胺间的强的分子内电荷转移，探针处于暗态。与硫醇反应后磺酰胺基团断裂，释放出显色团，分子内电荷转移受阻，荧光团的荧光恢复。半胱氨酸、谷胱甘肽和巯基丙酸能使 12 或 13 的荧光增强 20 到 53 倍。探针 12 被应用于嗜铬细胞瘤细胞核洋葱表皮细胞硫醇荧光成像。在洋葱表皮细胞成像表明强的荧光集中在细胞质，细胞核显示弱的荧光。由于强的恶水性，探针 12 的细胞膜穿透能力较弱，不能应用于洋葱表皮细胞成像。HNSOO2NNO2NHSO2NNO2O12H
15、NSOO2NNO2NH213Maeda 等报道了基于荧光素的探针 14 和 1515.由于 2，4-二硝基苯磺酰基强的吸电子作用，导致荧光素荧光猝灭。由于硫醇强的亲核作用，与探针反应断裂 2，4-二硝基苯磺酰基，释放出荧光素，荧光素强的荧光恢复。在 HEPES 缓冲溶液中 14 和 15 的量子效率为 0.0007 和 0.0003， 14 与 15 与 GSH 在 p H7.4和 37的反应速率常数为 1.7102和 1.4102M-1S-1。半胱氨酸和巯基丙胺的与 GSH 相似，巯基丙酸的较慢些。检出极限低于 2.0pmol/L。OCOHR ROSO2NNO2O14R=H15R=CH3Wa
16、ng 等报道了基于部花青显色团的荧光探针 1616.当硫醇断裂强吸电子2，4-二硝基苯磺酰基，释放出离子化羟基的 16.这使部花青显色团的分子内电荷转移增强。导致在吸收光谱上大的红移（380nm 红移至 530nm）和“关-开”类型的荧光检测，颜色也由黄色变为橙色。线性范围为 1.010-7 mol/L 到8.010-5 mol/L。对谷胱甘肽的检测极限为 2.410-8mol/L。NI OSO2NNO2RSH NI O164 基于硒氮键断裂谷胱甘肽过氧化物酶类似物 Ebselen 是在生物抗氧化防御体系关键的硒酶，有好的治疗学性能和低毒性，在生物和医学有重要的作用 17。Ebselen 含有
17、能与巯基发生特异反应的硒氮键。受此启发，一些基于硒氮键的硫醇探针被报道。Tang等报道了基于罗丹明6G的荧光探针（Rh-Se）17于识别硫醇 17。17有较弱的荧光，由于巯基强的亲核作用使硒氮键断裂释放出有强烈荧光的罗丹明6G。激发波长为525nm，通过检测在550nm荧光强度的变化实现对硫醇的检测。在3.0 10 -9 到1.2 10 -7 M有良好的线性系数。检测极限为1.4nM。Zhu 报道了利用吸收红移和荧光增强双重检测的硫醇探针 1818， 在 DMF 和水 (8:2, v/v)混合溶液中硫醇与 piazselenole 反应产生供电性强的邻苯二胺，从而导致吸收波长发生 19nm 的
18、红移和 3 倍量的荧光增强。利用吸收法测量的线性检测范围为 4-12M，检测极限为 0.5M。荧光法线性检测范围是 2-12M，检测极限为 0.03M。相对于巯基丙酸、巯基丙胺、半胱氨酸等非蛋白质硫醇，探针 18 对谷胱甘肽显示了更强的响应。 NNSeNI GSHNH2NNH2I185 置换反应在众多的硫醇检测体系中，利用硫醇和铜、汞、镉等软酸的强的亲和力传感器受到广泛关注。这类传感器最大的优势是能在水溶液中进行。Shao 等报道了基于螺吡喃的探针 1919.金属离子如铜离子和汞离子能导致螺吡喃开环，形成紫红色的部花青结构。在铜离子或汞离子存在下，半胱氨酸通过巯基失质子形成胱氨酸。胱氨酸与铜离
19、子和 19 形成 1：2：2 的三重组合体。紫外光谱最大吸收峰由 532nm 蓝移至 405nm，伴随颜色由紫红色变为黄色。该体系的检测极限为 4.010-8M。文章指出在铜离子或汞离子存在下，即使是无氧条件，半胱氨酸也能被氧化为胱氨酸。证明了半胱氨酸的氧化为铜离子或汞离子催化氧化。Han 和 Kim 报道了利用 Cd-TPXD 和邻苯二酚紫组成 2：1：1 蓝色的传感系踪物 20 在 pH7.0-8.5 选择识别半胱氨酸 20。把半胱氨酸加入到传感系踪物的水溶液中，体系颜色由蓝色变为黄色。这是由于相比于 Cd2+（软酸）与邻苯二酚紫的两个酚羟基（硬碱）弱的键，软碱巯基与软酸 Cd2+有更强的
20、亲和力，从而释放出邻苯二酚紫，实现对半胱氨酸的目视检测。Liao 等利用桑色素（21）发展了一种简单灵敏的荧光增强检测痕量 cys 的方法。在 pH7.4Britoon-Robinson 缓冲溶液中，将 cys 加入 Cu2+-桑色素（1：2）体系中由于竞争取代，释放出显色团桑色素，在 539nm 处荧光强烈的增强。在 6.5210-7-2.2010-5molL-1范围内荧光强度与 cys 浓度呈现良好的线性关系，方法的检测线为 6.5210-8 molL-1.方法被应用到检测鲜猪血和人尿液蛋白质水解产生的 cys。Zhang 最近报道了 22 与 Cu2+形成 2：1 的传感系踪物通过直接取
21、代反应在水溶液中比色检测 cys 和 hcy 的方法。在 pH7.0 缓冲溶液中加入 cys 或 hcy，释放出显色团 22，导致紫外光谱 498nm 处吸收增强，颜色由黄色变为红色。其它氨基酸不干扰测定。 OHOOHOHHOOHO21 NNOHSO3H26、硫醇与方酸衍生物缺电子四元环加成方酸有缺电子中心四元环，是一种强的亲电试剂。并且方酸有长的吸收和发射波长，在水溶液中有好的荧光性能。因此，方酸衍生物也被应用于硫醇检测。Ros-Lis 等合成了水溶性方酸衍生物 23 和 2421。该探针在乙腈：水 20:80 （v/v）混合溶液中在 640nm 有强的荧光，与硫醇反应后荧光猝灭，溶液颜色也
22、由蓝色变为无色。乙醇、苯酚、胺、不含巯基氨基酸、硫化物、以及强亲典型的氰根没有导致光谱和颜色变化。探针 1 和 2 被成功应用于检测血浆中硫醇的含量。Sreejith 等报道了近红外方酸染料 2522。脂肪族硫醇加成在四元环上，改变了吡咯基团与四元环的的双键，破坏了两个吡咯基团间的 共轭，导致两个初级显色团的重组。在乙腈：水（1：1）溶液中，加入氨基硫醇，最大吸收峰由红外区（750nm）红移至可见区（440nm），颜色也由绿色变为亮黄色。当激发波长 730nm 时，探针在 800nm 处弱的荧光发射峰降低。激发波长为 410nm 时，探针在 592nm 处出现新的强发射峰和亮橙色荧光。通过检测
23、在两个不同激发波长的发射，可实现对生物样品氨基硫醇的检测。探针被成功应用于检测和评价血浆中氨基硫醇的含量，并且证实了吸烟能导致血浆中氨基硫醇含量的增高。7、醛基与含氮末端硫醇的反应推-拉类型的分子，由于醛基强的吸电子效应，受到激发时发生分子内电荷转移。当溶液中加入Cys或Hcy，醛基与氮末端硫醇反应生成thiazolidines 或 thiazinanes，由于烃基弱的给电子效应，阻止了分子内的电荷转移。因此将会发生吸收和发射光谱上的蓝移。NHSCO2nRRCHOCys/HcyICTn ICTOf n=1n2Rusin 等报道了利用荧光素二醛 26 选择性识别半胱氨酸和高半胱氨酸 23。加入半
24、胱氨酸或高半胱氨酸，紫外吸收光谱发生红移，荧光猝灭，溶液颜色由亮黄色变为棕黄色。其它常见硫醇、氨基酸、胺、牛血清蛋白、尿素酶干扰很小。Zhang 等报道了比色传感器 27 和 2824.27 在 DMF 中最大吸收峰在 465nm，加入 cys，最大吸收峰蓝移至 442nm。为增加探针的水溶性，在 28 中引入两个羟基。28 中硝基的存在增强了分子内电荷转移，使最大吸收峰红移至 515nm。在 DMF-水（9：1）溶液中，醛与 cys 和 hcy 反应降低了 28 的吸电子能力，导致探针的 ICT 受阻，最大吸收峰由 515nm 蓝移至 475nm。溶液也由粉红色变为黄色。其它氨基酸和谷胱甘肽
25、不干扰测定。对 cys 和 hcy 显示了良好的选择性。由粉红色变为黄色。OCOHO OHO O26 OHC NNOHC N NOHOHNO2278Chen 等报道了荧光增强的 Hcy 磷光化学传感器 2925. 在含 29 的 DMSO-HEPES 中(pH 7.2, 9:1 v/v) hcy 导致在 525nm 处磷光大的增强。1-hcy 的发光量子产率为 0.38，比 1-cys 的（0.002）明显高出很多。首次通过发射峰和荧光强度变化区分开 cys 和 hcy。其它氨基酸和相关硫醇多肽不干扰测定。但是 DMSO-HEPES(9:1 v/v)是生物不适应性的，需要 200 倍的 HCY
26、（4mM）降低了体系的灵敏度。Huang等报道了基于铂化合物的磷光探针4 26.同时设计了不含醛基的对比化合物5.2在560nm有强的橘黄色发射峰，由于醛基强的吸电子能力，1的最大发射波长蓝移至510nm，发光颜色变为相应的绿色。1在乙腈：水(40 lM, pH7.2, 4:1 v/v)溶液中量子产率为1.4.加入hcy，最大吸收峰红移至555nm，相应的发光颜色由绿色变为橘黄色。其它氨基酸及谷胱甘肽不干扰测定。Zhang 等报道了 Y 形双光子荧光传感器 3127.相比于单光子荧光探针，双光子荧光探针的激发波长在近红外区，有很低的背景光，弱的光致伤害，在低浓度有高的发射。这些特性使双光子探针
27、适于生物成像。在 DMF 中，cys 导致 31的单光子激发荧光发射光谱明显的改变，发射峰由 535nm 蓝移至 498nm，量子产率由 0.66 降低至 0.31，相应的荧光颜色由绿色变为青色。双光子激发荧光发射光谱研究显示，在 787nm 激发，31 的双光子激发荧光强度是 31-cys（40倍量）的 10 倍，伴随着 30nm 蓝移。NCHOIrOO229NNPt CHOCHO30 CHONHNH3CO2 CO2H331Duan等报道了荧光探针32 28. 32是一个电子受体-芳香荧光团-电子受体-共轭体系。当32与cys反应，由于烃基弱的推电子能力，-共轭变为电子受体-芳香荧光团-电子
28、给体。因此推-拉效应更有效，导致高的荧光量子产率和伴随发射光谱红移。在乙醇：水(60:40, v/v) pH 7.2HEPES 缓冲(50 mM)，将cys加入含32的溶液中，最大吸收峰由375nm蓝移至370nm。同时荧光发射增强伴随着25nm红移，荧光量子产率由0.25增至0.40，荧光颜色由蓝变青。探针被应用于V79细胞成像。NOOOHCCHO32Lin 等报道了基于分子内电荷转移的荧光探针 3329.当染料富电子基团共轭缺电子基团，受到激发将会发生从供体到受体的分子内电荷转移（ICT）。当cys 或 hcy 和探针反应，探针电子供体-受体体系共轭破坏，ICT 被关闭，导致吸收和发射波谱
29、上较大的蓝移。在 10 mMHEPES buffer, pH 7.4/DMF (v/v, 1: 3)中，加入 cys 或 hcy 探针最大吸收峰由 376nm 蓝移至 330nm，荧光发射光谱由 519nm 到 376nm 发生 125nm 蓝移。在 394nm 和 519nm 处荧光强度之比I394/I519，加入 cys 增强 176 倍，加入 hcy 增强 920 倍。探针的荧光颜色也由绿变蓝。加入其它氨基酸、葡萄糖、含硫化合物没有导致明显的光谱变化。探针对 cys 在 0.6 到 8010-5M 有良好的线性范围。生理学健康血浆中半胱氨酸的含量范围在 24-3610-5M，预示探针对检
30、测血浆中半胱氨酸有潜在的应用。NHN CHO NHN NHSCO2nICTOn ICTOfCys(n=1)Hcy(n2)3Kim 等在 2008 年报道了两个香豆素分子（34 和 35） 30-31。在含有 34 的 pH 7.4HEPES 缓冲溶液中，加入 hcy 450nm 荧光发射强度增强 100 倍，加入 cys 增强 49 倍。在 365nm 激发，只有含 cys 和 hcy 的探针溶液显示亮蓝色荧光。探针荧光增强可能因为以下两个原因：第一、将 hcy 加入探针 34 中，苯酚质子和thiazinane 氮原子形成氢键，阻止了在先前报道的 thiazinane 香豆素可能发生的 PE
31、T 猝灭。第二、thiazinane 的形成，羰基 sp2 杂化轨道转化为 sp3 杂化轨道，使从香豆素 HOMO 到醛羰基 LUMO 的电荷转移导致的荧光猝灭被降低，从而使探针的荧光增强。在含有 10mM 谷胱甘肽人血浆中，荧光增强也被观察到。OOOOHH Cys(n=1)Hcy(n2) OOOHSNOCHn34探针 35 含有推-拉类型的香豆素荧光团 31。二乙基胺基团推电子，醛基和羰基拉 电子，35 在 488nm 产生强的荧光发射。在乙醇溶液中加入 500 倍量Hcy 或 cys，由于 36 的荧光团附近 thiazinane/thiazolidine 的氮原子有一对孤电子，产生光致诱
32、导电子转移使 1 的荧光猝灭。发射峰也蓝移至 470nm。OOEt2N HOCys(n=1)cy(n2) OOEt2N NHSCHOCO2nPET35 36Li 等报道了探针 3732，37 能在水溶液和活细胞中从 hcy 和 GSH 中有效的区分 cys。37 无色有弱的荧光。在含有 37 的乙醇-PBS (0.1 M, pH=7.00, 3 : 7,v/v)溶液中，加入 200Mcys，在 531nm 出现新的吸收峰，荧光增强 20 倍。37 溶液的荧光强度在 M 级与 cys 成线性比例，检测极限为 7.35 10-8 M.加入Hcy 导致小的荧光减弱。其它氨基酸和 GSH 不干扰测定。
33、比 hcy 高的选择性可能是因为与不饱和醛反应，37 与 cys 反应产生五元杂环，形成不稳定的化合物38，接着发生开环反应促进 39 水解为 40，导致荧光增强，溶液颜色由无色变为紫色。37 与 hcy 反应生成 41，但为无色并无荧光。37 被应用于 MCF 和 PC12细胞成像。对细胞内 cys 浓度改变产生变化。并用于检测人尿液 cys，与文献报道数据相符。ONOEtHN NHEtCHO ONOEtHN NHEt ONOEtHN NHEtOOOEtHN NHEtONOEtHN NHEtSNHCOH SNHCOHNCOHHSHcyCys ring-openhydrolysi37 38 3
34、941 408、基于巯基亲核加成Zhang 等报道了一个发射增强荧光 cys/hcy 探针 38 并应用于生物成像 33。在含有 38 的甲醇：HEPES（7：3，v/v）pH=7 的缓冲溶液中，加入 cys 或 hcy，最大吸收峰由 430nm 红移至 580nm，在 465nm 有一个明显的等吸收点，相应的颜色由黄绿色变为橘红色。激在发波长为 465nm 时，加入 40 倍的 hcy，含有 38的溶液 588nm 处荧光增强 75 倍，相应强烈的橘红色荧光。由于位阻效应，其它硫醇在此条件下几乎不发生反应。38 被应用于激光共聚焦成像（CLSM）和双光子荧光成像（TPLSM）。淋巴囊癌细胞（
35、ACCM）激光共聚焦成像能显示 cys 和hcy 的亚细胞分布。在 880nm 双光子荧光成像显示，胰腺癌细胞（PANC）的荧光信号定位在细胞核周围区域和类似核仁区域，HeLa 细胞的荧光广泛分布在细胞液和细胞核。PANC 和 HeLa 荧光成像的不同显示不同细胞内 cys 和 hcy 的代谢机理是有差异的。Huang 等报道了一个基于苯醌-甲基-类型反应的长波长硫醇荧光探针3934。探针 39 在生理条件和水溶液中与硫醇自发的发生不可逆的氧化还原反应。首先硫醇导致苯醌还原，随后发生苯醌-甲基-类型重排反应，释放出在 595nm处有强烈荧光的荧光团 40。其它氨基酸和生物还原剂不干扰测定。在
36、1-100M范围内荧光强度与硫醇浓度呈现良好的线性关系。NONC38 OOCNOSNOO HOOCNOSN39 40Zeng 等发展了一个基于 ICT 机理的硫醇和过度金属离子的双重比色化学传感器 4135。41 在 450-700nm 有一个强的 ICT 吸收带。当加入 cys，由于 cys 的巯基在苯醌的 1 位亲核加成导致苯醌转化为相应的对苯二酚，降低了苯醌的受电子能力，ICT 吸收带强度逐渐降低，溶液的颜色也由深紫色变为无色。其它硫醇显示了相同的变化，而其它氨基酸没有导致光谱上明显的改变。 NNOO NNHOOHRS41Yi 等报道了一个基于光致诱导电子转移（PET）的高灵敏荧光探针4
37、236。42 由香豆素作为荧光团和马来酰亚胺作为硫醇的受体。分子内双键有效的光致诱导电子转移使荧光团的荧光猝灭，42 荧光量子产率仅为 0.001。X 晶体衍射分析显示 42 包含一个能与硫醇发生 Michael 加成反应的顺势双键。混合42 与硫醇立刻观察到蓝绿色荧光，在 pH7.4 和 25 ，42 与 cys 的反应速率常数为 7.010 M-14s-1。与谷胱甘肽反应后荧光增强 470 倍，产物量子产率为0.47。其它氨基酸、氧化态谷胱甘肽（GSSG）和胱氨酸没有产生明显的光谱变化。探在 0-100nM 范围内荧光强度与谷胱甘肽浓度呈现良好的线性关系，针的检测线为 0.5nM。探针被用
38、于检测谷胱甘肽还原酶（GR）的活性。人胚胎肾细胞（HEK-293）激光共聚焦成像显示 42 有良好的细胞膜渗透性。OHO NHOOOO42Huo 等将色烯衍生物 43 应用于比色检测硫醇 3。在含有 43 的 HEPES pH7.0缓冲溶液中加入 cys，硫醇强亲核性的巯基与 43 发生 Michael 加成，然后色烯通过开环释放 4-硝基苯酚基团，最大吸收峰由 292nm 红移至 405nm（红移113nm），颜色由无色变为黄色。通过检测 405nm 处吸收峰强度可实现对 cys浓度的检测。在 pH7.4 和 25，速录常数为 kobs=0.62s-1，t 1/2=1.0s，指示在实验条件下
39、 43 与 cys 反应迅速。其它氨基酸和常见阴离子，如 F-、Cl -、Br -、I -、AcO -、SCN -、NO 3-、SO 42-、CO 32-、 -OOCCOO-、PO 43-不干扰测定。43 为利用色烯衍生物设计比色或荧光硫醇探针提供了一个新的模型，基于此方法的传感器在将来可能被广泛开发。OOO2N RS OOO2NRS OOO2NSR43Lin 等报道了一个基于硫醇与 ，-不饱和酮 1，4 共轭加成反应的荧光探针 441.在 pH7.4 磷酸缓冲溶液中，44 无荧光，加入 cys，最大吸收峰由 466nm蓝移至 444nm，在 453nm 出现等吸收点。激发波长为 444nm
40、时，在 496nm 出现新的发射峰，荧光强度增强 211 倍，荧光颜色由黑色变为无色。检测线为9.2510-7M。Hcy 和谷胱甘肽分别导致 180 和 35 倍荧光增强。其它氨基酸、金属离子（Na +、Ca 2+、Mg 2+、Fe 3+、和 Zn2+）、活性氧基团（过氧化氢）、还原剂（烟碱腺嘌呤二核苷酸）、核苷和葡萄糖没有引起明显的光谱变化。OONOEt2N OONOEt2NRSH SR4References(1) Lin, W. Y.; Yuan, L.; Cao, Z. M.; Feng, Y. M.; Long, L. L. Chemistry-a European Journal 2
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