兔羊养殖.doc

1、1（2）新型日粮配方在肉兔养殖中的应用效果日增重、日采食量、料重比、体长，饲料转化率，皮张面积、胴体重、屠宰率，p H、失 水 率 、 熟 肉 率 及 嫩 度 。（3）机理研究肉兔肠道菌群变化规律研究及内容物酸碱度测定大肠杆菌活菌计数：伊红美兰培养基成分：蛋白胨 20g，乳糖 10g，磷酸氢二钾 2g，琼脂 17g，2%伊红 Y 溶液 20mL，0.65%美兰溶液 10mL，蒸馏水 1000mL，pH7.1。制法：将蛋白胨、磷酸氢二钾和琼脂溶解于蒸馏水中，校正 pH，分装于烧瓶内，高压灭菌121，15min 备用。临用时，加入乳糖，并加热溶化琼脂，冷至 5055，加入伊红和美兰溶液，摇匀，倾注

2、平板乳酸菌活菌计数：MRS 培养基成分：蛋白胨 10g，牛肉膏 10g，酵母粉 5g，K 2HPO4 2g，柠檬酸二铵 2g，乙酸钠 5g，葡萄糖 20g，吐温 80 1mL，MgSO4 .7H2O 0.58g，MnSO 4 4H2O 0.25g， （琼脂 1520g） ，蒸馏水 1000mL。制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调 pH 至 6.26.4，分装于三角瓶中，121,灭菌 15min。双歧杆菌活菌计数：BBL 培养基成分：蛋白胨 15g，葡萄糖 20g，酵母浸粉 2g，可溶性淀粉 0.5g，氯化钠 5g，L-半胱氨酸0.5g，番茄浸粉 5g， 肝浸粉 2g，琼脂 20

3、g，25 pH 值 7.00.1用法：称取本品 70.0g，再吸取吐温 80 1ml，加热溶解于 1000ml 蒸馏水中，分装三角瓶，115 高压灭菌 20 分钟备用。芽孢杆菌活菌计数：加热处理后 NA 培养基计数成分：牛肉浸膏 3g，蛋白胨 5g，葡萄糖 2.5g，琼脂 18g，25 pH 值 7.00.1用法：称取本品 28.5g，加热溶解于 1000ml 蒸馏水中，分装， 121高压灭菌 15 分钟，备用。内容物道酸碱度的测定将雏鸡肠道内容物约 1g 置于 EP 管中加蒸馏水至 1mL，离心沉淀并将上清液取出稀释至 20mL，用数显笔式 pH 计分别测定十二指肠、空肠、回肠、盲肠及粪便内

4、容物稀释液的pH 值并记录结果。肉兔胃及肠道中各种消化酶的变化规律研究2对供试肉兔胃及肠道内容物进行淀粉酶、糖化酶、木聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、纤维素酶、木质素酶活力测定，拟采用的方法如下：1.蛋白酶活力测定方法：福林法 SB/T10317-1999；1.1 试剂及溶液：以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin 试剂 )：于 2000 mL 磨口回流装置内 ,加入钨酸钠(Na 2WO42H2O) 100 g，钼酸钠(Na 2MoO42H2O)25 g，蒸馏水 700 mL，85%磷酸 50 mL，浓盐酸 100 mL，文火回流 10 h。 取去冷凝器，加入硫酸锂(Li 2SO4

5、)50 g，蒸馏水 50 mL，混匀，加入几滴液体溴，再煮沸 15 min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，,再煮沸除去之。冷却后,定容至 1000 mL，用细菌漏斗(No 45)过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加 2 倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 1.1.2 0.4 mol 碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠(Na 2CO3)42.4 g，定容至 1000 mL。 1.1.3 0.4 mol 三氯乙酸(TCA)溶液：称取三氯乙酸(CCl 3COOH)65.4 g，定容至 1000 mL。 1.1.4 pH7.2 磷酸盐缓冲液: 称取磷酸二氢钠

6、(NaH 2PO42H2O)31.2 g，定容至 1000 mL，即成0.2 mol 溶液(A 液)。称取磷酸氢二钠(Na 2HPO412H2O)71.63 g，定容至 1000 mL，即成 0.2 mol 溶液(B 液)。 取 A 液 28 mL 和 B 液 72 mL，再用蒸馏水稀释 1 倍，即成 0.1 mol pH7.2 的磷酸盐缓冲液。 1.1.5 2% 酪蛋白溶液:准确称取干酪素 2 g，称准至 0.002 g，加入 0.1N 氢氧化钠 10 mL，在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用 pH7.2 磷酸盐缓冲液定容至 100 mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存

7、，否则极易繁殖细菌，引起变质。 1.1.6 100 g/mL 酪氨酸溶液：精确称取在 105烘箱中烘至恒重的酪氨酸 0.1000 g，逐步加入 6 mL 1N 盐酸使溶解，用 0.2N 盐酸定容至 100 mL,其浓度为 1000g/mL，再吸取此液10 mL，0.2N 盐酸定容至 100 mL，即配成 100 g/mL 的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。1.2 仪器 a. 分析天平：感量 0.1mg；b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计；c. 水浴锅；d. 1、2、5、10 mL移液管等。 1.3 操作 1.3.1 标准曲线的绘制 31.3

8、.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表 1)。管号试剂1 2 3 4 5 6蒸馏水，mL 10 8 6 4 2 0100g/mL 酪氨酸，mL 0 2 4 6 8 10酪氨酸最终浓度，g/mL 0 20 40 60 80 1001.3.1.2 测定步骤：取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸 1 mL，各加入0.4mol碳酸钠5 mL，再各加入已稀释的福林试剂1 mL。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20 min在581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD) (滤色片用65*#)或用72型分光光度计进行测定(波长660 nm)。一般测三次，取平均值。将16号管所测得的光密度(OD

9、)减去1号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。为了清楚起见。再列出表格如下(表2)。 表 2试剂 管号按表1制备的不同浓度酪氨酸，mL1 2 3 4 5 60.4mol/L Na2CO3， mL1 1 1 1 1 1福林试剂，mL 5 5 5 5 5 51 1 1 1 1 1 123OD值平均净OD值 0以净 OD 值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度 OD 所相当的酪氨酸量 K)。 1.3.2 样品稀释液的制备 1.3.2.1 测定酶制剂：称取酶粉 0.100g，加入 pH7.2 磷酸盐缓冲液定容至 100mL，吸取此液5mL，再用缓冲液稀释至 25mL，

10、即成 5000 倍的酶粉稀释液。 1.3.2.2 测定成曲酶：称取充分研细的成曲 5g，加水至 100 mL，在 40水浴内间断搅拌 1 4h，过滤，滤液用 0.1 mol pH 7.2 磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数 (估计酶活力而定)。 1.3.3 样品测定：取15100 mm试管3支，编号1、2、3(做2只也可)，每管内加入样品稀释液1 mL，置于40水浴中预热 2 min，再各加入经同样预热的酪蛋白1 mL，精确保温10 min，时间到后,立即再各加入0.4 mol三氯乙酸2 mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20 min，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取15150 mm试管3支，

11、编号1、2、3，每管内加入滤液1 mL，再加0.4 mol碳酸钠5 mL，已稀释的福林试剂1 mL，摇匀，40 保温发色20 min后进行光密度(OD)测定。 空白试验也取试管3支，编号(1)、(2) 、(3),测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白。 为了清楚起见，分别列出表格于下(见表 3 及表 4)。表 3管号 管号试剂1 2 3试剂（1）（2）（3）预热酶液，mL 1 1 1 预热酶液，mL 1 1 1预热 2%酪蛋白，mL1 1 10.4 mol 三氯乙酸， mL2 2 2作用 10 min（精确计时）作用 10 min（精确计时）0

12、.4 mol 三氯乙酸，mL2 2 2预热 2%酪蛋白， mL1 1 1表 4管号试剂1 2 3 （1） （2） （3）滤液，mL 1 1 1 1 1 10.4 mol Na2CO3，mL 5 5 5 5 5 5福林试剂，mL 1 1 1 1 1 15OD 值平均 OD 值净 OD 值 0样品的平均光密度 (OD)一空白的平均光密度(OD)=净 OD 值。1.4 计算 在40下每分钟水解酪蛋白产生 1g酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位式中：A由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值K) ；44毫升反应液取出1 mL测定(即4倍)；N酶液稀释的倍数；10反应10 min；W样品

13、水分百分含量。 1.5 注意事项 以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶，则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应 pH缓冲液即可。现把几种常用pH缓冲液配方提供如下：1.5.1 pH7.5磷酸盐缓冲液(0.02 mol/L) 称取磷酸氢二钠(Na 2HPO412H2O)6.02g和磷酸二氢钠 (NaH2PO42H2O)0.5 g以蒸馏水溶解定容至1000 mL。 1.5.2 pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液(0.05 mol) A 液：称取80%90% 乳酸 10.6 g，加蒸馏水稀释定容至 1000 mL。 B 液：称取 70%乳酸钠16 g

14、，加水稀释定容至1000 mL。 取A液16 mL与B液1 mL混合稀释一倍即成。 1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05 mol) A 液：称取80%90% 乳酸 10.6 g，以水定容至1000 mL。 B 液：称取 70%乳酸钠16 g，蒸馏水溶解定容至1000 mL。 取A液8 mL与B液1 mL，混合稀释一倍即成。 1.5.4 pH10硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液：称取硼砂19.08 g，用蒸馏水溶解定容至1000 mL (0.05 mol)。 6B 液：称取氢氧化钠8 g，用蒸馏水溶解定容至1000 mL (0.2N)。 取A 液250 mL，B 液215 mL混合

15、，用蒸馏水稀释定容至1000 mL即成。 1.5.5 pH 11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液：称取硼砂19.08 g，用蒸馏水定容至1000 mL。 B 液：称取氢氧化钠4 g，用蒸馏水定容至1000 mL。 取A液与B液等量混合。 1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时，须先加数滴浓乳酸，使之湿润以加速其溶解。2.-葡聚糖酶活力的测定方法：分光光度法 NY/T911-204；2.1 试剂：称取：冰乙酸钠 23.14 g，加入冰乙酸 1.70 mL，再加水溶解，定容至 2000 mL，测定溶液的 pH，如果 pH 偏离 5.5，再用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至 5.5。2.1.1 葡萄糖溶液，

16、浓度 c(C6H12O6)为 10.0 mg/ml称取无水葡萄糖 1.000 g，加乙酸乙酸钠缓冲溶液溶解，定容至 100mL。2.1.2 -葡聚糖溶液，浓度为 8.0 g/L称取 -葡聚糖 0.40 g，加入乙酸 5.0 mL 润湿 -葡聚糖，再加入 40 mL 乙酸乙酸钠缓冲溶液磁力搅拌，同时缓慢加热，直至 -葡聚糖完全溶解。 （注：在搅拌加热的过程中，可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过 50 mL）然后，停止加热，继续搅拌 30 min，用乙酸乙酸钠缓冲液定容至 50 mL，- 葡聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4避光保存，有效期为 3 d。冷却保存，有效期为 2 个月（

17、使用前在 4条件下解冻） 。2.1.3 DNS 试剂称取 3,5-二硝基水杨酸 3.15 g（化学纯） ，加水 500 mL，搅拌 5 s，水浴至 45。然后，逐步加入 100 mL 氢氧化钠溶液，同事不断搅拌，直至溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过 48） 。再逐步加入四水酒石酸钾钠 91.0 g、苯酚 2.50 g 和无水亚硫酸钠 2.50 g。继续 45水浴加热，同时补加水 300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶液。停止加热，冷却至室温后，用水定容至 1000 mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放 7 d 后可以使用，有效

18、期为 6 个月。2.2 仪器与设备分子筛 孔径为 0.25 mm（60 目）分析天平 感量 0.001 gpH 计 精确至 0.017磁力搅拌器电磁振荡器烧结玻璃过滤器 孔径为 0.45m离心机 3000 r/min恒温水浴锅 温度控制范围在 3060之间，精度为 0.1秒表分光光度计 能检测 350 nm800 nm 的吸光度范围 2.3 标准曲线的绘制吸取乙酸乙酸钠缓冲液 4.0 mL，加入 DNS 试剂 5.0 mL，沸水浴加热 5 min。用自来水冷却至室温，用水定容至 25.0 mL，制成标准空白样。分别吸取葡萄糖溶液 1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、

19、5.00 mL、6.00 mL 和 7.00 mL，分别用缓冲液定容至 100 mL，配制成浓度 0.10 mg/mL0.70 mg/mL 葡萄糖标准液。分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00 mL（做 2 个平行） ，分别加入到刻度试管中，再分别加入 2.0 mL，缓冲液和 5.0 mL DNS 试剂。电磁震荡 3 s，沸水浴加热 5 min。然后，用自来水冷却到室温，再用水定容至 25 mL。以标准空白样为对照调零，在 540 nm处测定吸光度 OD 值。以葡萄糖浓度为 Y 轴、吸光度 OD 为 X 轴，绘制标准曲线。每次新配制 DNS 试剂均需要重新绘制标准曲线。2.4 试样溶

20、液的制备固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过 60 目筛（孔径为 0.25 mm） ，按照附录 A 中建议的称样量称取试样 2 份，精确至 0.001 g。加入 40 mL 乙酸乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌 30 min，再用缓冲溶液定容至 100 mL，在 4条件下避光保存 24 h。上离心机离心 3 min，取上清液，再用缓冲溶液做适当稀释（稀释后的待测酶液中 -葡聚糖酶活力最好能控制在 0.04 U/mL0.08 U/mL 之间） 。液体样品可以直接用乙酸乙酸钠缓冲溶液进行稀释、定容（稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在 0.04 U/mL0.08 U/mL 之间） 。如果稀释后酶液的 pH

21、偏离 5.5，需要用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节校正至 5.5，然后再用缓冲溶液做适当稀释定容。2.5 测定步骤吸取 10.0 mL -葡聚糖溶液， 37平衡 20 min。吸取 10.0 mL 经过适当稀释的酶液，37平衡 10 min。吸取 2.00 mL 经过适当稀释的酶液（已经过 37平衡） ，加入到刻度试管中，再加入 5 8mL DNS 试剂，电磁振荡 3 s。然后加入 2.0 mL -葡聚糖溶液，37 平衡 30 min，沸水浴加热 5 min。用自来水冷却至室温，加水定容至 25 mL，电磁振荡 3 s。以标准空白样为空白对照，在 540 nm 处测定吸收度 AB。吸取 2.00 m

22、L 经过适当稀释的酶液（已经过 37平衡） ，加入到刻度试管中，再加入 2.0 mL -葡聚糖（已经过 37平衡） ，电磁振荡 3 s，37 精确保温 30 min。加入 5.0 mL DNS 试剂，电磁振荡 3 s，以终止酶解反应。沸水浴加热 5 min，用自来水冷却至室温，加水定容至25 mL，电磁振荡 3 s。以标准空白样为空白对照，在 540 nm 处测定吸光度 AE。2.6 试样酶活力按式（1） 、式（2）计算式中：X D试样稀释液的 -葡聚糖酶活力，单位为酶活力单位每毫升（ U/mL） ；AE酶反应液的吸光度；AB酶空白样的吸光度；K标准曲线的斜率；CO标准曲线的截距；M葡萄糖的摩

23、尔质量 M（C 6H12O6）=180.2 g/mol ；t 酶解反应时间，单位为分钟（min） ；1000转化因子，1 nmol=1000mol；XD值应在 0.04 U/mL0.08 U/mL 之间，如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，在进行分析测定。X试样中 -葡聚糖酶的活力，单位为酶活力单位每克（U/g） ；Df试样的稀释倍数。酶活力的计算值保留 3 位有效数字。2.7 重复性每个试样应取 2 份平行样进行分析测定，相对误差不超过 8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留 3 位有效数字） 。附录 A（资料性附录）建议称样量9-葡聚糖酶活力，U/g 称样量，g2000

24、0.10.25002000 0.20.5200500 0.51.050200 1.02.01050 1.05.0110 5.010.03.植酸酶活力的测定：分光光度法 GB/T 18634-2009；3.1 试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。清洗试验用器皿不要用含磷清洗剂。 磷酸二氢钾：基准物。 乙酸缓冲液（1） ，c （ CH3COONa）=0.25 mol/L：称取 20.52 g 无水乙酸钠于 1000 mL 烧杯中，加入 900 mL 水搅拌溶解，用冰乙酸调节 pH 至 5.500.01，在转移至 1000 mL 容量瓶中，并用蒸

25、馏水定容至刻度。室温下存放 2 个月内有效。乙酸缓冲液（2） ，c （CH 3COONa）=0.25 mol/L：称取 20.52 g 无水乙酸钠，0.5 g 曲拉通X100（Trion X100） ，0.5 g 牛血清蛋白（BSA）于 1000 mL 烧杯中，加入 900 mL 水搅拌溶解，用冰乙酸调节 pH 至 5.500.01，在转移至 1000 mL 容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。室温下存放 2 个月内有效。 底物溶液，c（C 5H6O24P6Na12）=7.5 mmol/L：称取 0.69 g 植物钠（C 5H6O24P6Na12，相对分子质量为 923.8，纯度为 95%） ，精

26、确至 0.1 mg，置于 100 mL 烧杯中，用约 80 mL 乙酸缓冲液（2）溶解，用冰乙酸调节 pH 至 5.500.01，转移至 100 mL 容量瓶中，并用乙酸缓冲液（2）定容至刻度，现在现配（实际反应液中的最终浓度为 5.0 mmol/L） 。 硝酸溶液： 1+2 水溶液。 钼酸铵溶液， 100 g/L：称取 10 g 钼酸铵(NH4) 6Mo7O244H2O于 50 mL 烧杯中加水溶解，必要时可微加热，再转移至 100 mL 容量瓶中，加入 1.0 mL 氨水（25%）用水定容至刻度。偏钒酸铵溶液，2.35 g/L：称取 0.235 g 偏钒酸铵（ NH4VO3）于 50 mL

27、 烧杯中，加入 2 mL 硝酸溶液（）及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，在转移至 100 mL 棕色容量瓶中，用谁定容至刻度。避光条件下保存一周内有效。 酶解反应终止及显色液：移取 2 份硝酸溶液（ ） ，1 份钼酸铵溶液（） ，1 份偏钒酸铵溶液（）混合后使用，现用现配。103.2 仪器和设备 分析天平：感量 0.1 mg 恒温水浴： 370.1 分光光度计：有 10 mm 比色皿，可在 415 nm 下测定吸光度 磁力搅拌器 涡流式混合器 酸度计： pH 精确至 0.01 离心机：转速为 4000 r/min 超声波溶解器 回旋式振荡器3.3 试样制备3.3.1 固体样品按 GB/T 1469

28、9.1 的规定进行采样，选取有代表性样品，用四分法将试样缩分至 100 g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料需粉碎通过 0.45 mm 标准筛，装入密封容器，防止试样成分变化。3.3.2 液体样品按 GB/T 14699.1 的规定进行采样，选取有代表性样品用前摇匀。3.4 测定步骤3.4.1 标准曲线准确称取 0.6804 g 在 105烘至恒重的基准磷酸二氢钾于 100 mL 容量瓶中，用乙酸缓冲液溶解，并定容至刻度，浓度为 50.0 mmol/L。按表 1 的比例用乙酸缓冲液稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷的量为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程（y=a+bx） 。表

29、1 标准稀释比例标准溶液序号 稀释量/mL 溶液 /(mol/mL)1 0.516 1.56252 0.58 3.12503 0.54 6.25004 0.52 12.5005 0.51 25.000113.4.2 试样溶液的制备3.4.2.1 酶制剂样品中酶的提取参照附录 A 中建议的称样量称取植酸酶试样两份，精确至 0.0001 g，置于 100 mL 容量瓶中，加入乙酸缓冲液（2）摇匀并定容至刻度。放入一个磁力棒，在磁力搅拌器上高速搅拌 30 min。或在超声波溶解器上超声溶解 15 min，再放入回旋式振荡器中振荡 30 min。3.4.2.2 加酶饲料样品中酶的提取称取添加植酸酶的饲

30、料试样两份，精确至 0.0001 g，置于 200 mL 刻度锥形瓶中，加入乙酸缓冲液（2）100.0 mL.在超声波溶解器上超声溶解 15 min，在放入回旋式振荡器中振荡30 min。所有提取后的试样必要时在离心机上以 4000 r/min 离心 10 min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液（2）稀释，使试样溶液的浓度保持在 0.4 U/mL 左右，待反应。建议在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶参考样，便于检验整个操作过程是否有偏差。3.4.3 反应取 10 mL 试管按下面的反应顺序进行操作，标准空白加入 0.2 mL 乙酸缓冲液（2） 。在反应过程中，从加入底物溶液开始，向每支试管

31、中加入试剂的时间间隔要一致，在恒温水浴中 37水解 30 min。反应步骤及试剂、溶液用量见表 2.表 2 反应步骤及试剂、溶液用量反应顺序 样品、标准 样品空白1.加乙酸缓冲液 1.8 mL 1.8 mL2.加入待反应液 0.2 mL 0.2 mL3.混合 4.水浴中 37预热 5 min 5.依次加入底物溶液 4 mL 4 mL（第二步）6.混合 7.水浴中 37水解 30 min 8.依次加入终止及显色液 4 mL 4 mL（第一步）9.混合 12总体积 10 mL 10 mL3.4.4 样品测定反应后的试样在室温下静置 10 min，入出现混浊需在离心机上以 4000 r/min 离心

32、 10 min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计 415 nm 波长处测定试样空白（A 0）和试样溶液（A）的吸光值，AA 0 为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。3.5 结果计算和表示3.5.1 结果计算试样中植酸酶活性以 X 表示，单位为酶活性单位每克（ U/g）或酶活性单位每毫克（U/mL ） ，按下式计算：式中：X试样中植酸酶的活性，单位为酶活性单位每克（ U/g）或酶活性单位每毫克（U/mL） ；y根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的无机磷的量，单位为微摩尔（mol ） ；t酶解反应实际，单位为分钟（min） ；n试样的稀释倍数；m试样的量，单位为克（g）或毫

33、升（mL） 。3.6 结果表示两个平行试样的测定结果用算式平均值表示，酶制剂样品保留整数，加酶饲料样品保留三位有效数字。3.7 重复性同一试样两个平行测定值的相对偏差，植酸酶产品不大于 8%，添加植酸酶的各种饲料样品不大于 15%。附录 A（资料性附录）建议称样量根据样品植酸酶活性的不同，建议称样量见表 A.1植酸酶活性 /(U/g) 称样量/g5000 以上 0.11X=ynmt1310005000 0.215001000 121500 250.131 5104.-淀粉酶活性的测定：比色法 GB/T 5521-2008；4.1 试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯。实验用水符合 GB/

34、T 6682 中三级水的要求。 碘，碘化钾，氯化钙，无水乙酸钠，硫酸，冰乙酸，浮石粉； 可溶性淀粉注：可采用 Lintner 淀粉或质量相当的国产可溶性淀粉。 碘贮备液：称取 11.0 g 碘化钾荣誉少量水中，加 5.50 g 结晶碘，搅拌至碘完全溶解。再定容至 250 mL，置于棕色瓶中，在暗处贮存，此溶液可保存一个月。 碘稀释液：称取 40.0 g 碘化钾于水中，加 4.00 mL 碘贮备液，并稀释至 1 L，用时现配，不可过夜。 硫酸溶液： c（H 2SO4）=0.05 mol/L. 缓冲液：称取 164 g 无水乙酸溶于水中，加入 120 mL 冰乙酸，用水定容至 1 L.。 氯化钙溶

35、液： c（CaCl 2）=0.2% 。 -淀粉酶溶液：称取 10 g 有酶活性的黄豆粉（粗细度为通过 1.5 mm 孔筛） ，加入 85 mL水和 15 mL 0.05 mol/L 硫酸充分搅匀，静置 15 min，抽滤，该滤液即为 -淀粉酶溶液。 -极限糊精溶液：称取 5.00 g（干基）可溶性淀粉于小烧杯中，加入约 20 mL 水混匀，将其边搅拌边缓慢倒入盛有 100 mL 沸水的 500 mL 高型烧杯中，并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移至高型烧杯中，继续搅拌并加热，缓慢煮沸 2 min。加盖表面皿，在自来水中冷却至 30一下，加入 25 mL 缓冲溶液及 50 mL -淀粉酶溶液，在室

36、温下放置 20 h，加入 1 勺浮石粉，将此溶液在 10 min 之内缓慢煮沸，然后继续沸腾 5 min 以上。冷却至30以下，用水定容至 250 mL，摇匀，过滤。滤液中加几滴甲苯，此溶液的 pH 值应为（4.70.1） ，在 25以下可连续使用 5 天。4.2 仪器 恒温水浴： 300.2与 200.1各 1 台。 分光光度计或比色计。 秒表14 筛：孔径为 1.0 mm、 1.5 mm。 pH 计。 烧杯及高型烧杯： 100 mL、250 mL 、500mL。 容量瓶： 250 mL、1000 mL 锥形瓶： 300 mL。 移液管： 5 mL、20 mL。 分析天平：分度值 0.01

37、g4.3 操作步骤4.3.1 分光光度计及其空白调整将分光光度计连接稳压电源，预热 20 min，调整波长为 575 nm。将 2.0 mL 氯化钙溶液加到 10.0 mL 碘稀释液中，然后以适量的水（V 0）稀释（加水量一般为 20 mL40 mL，V 0详见 4.3.1） ，混匀后置于 20水浴中，用 1 cm 比色皿进行测试，调节仪器狭缝宽度，使吸光度为零。4.3.2 底物溶液的校准分别吸取 5.0 mL -极限糊精溶液和 15.0 mL 氯化钙溶液于一个 100 mL 烧杯中，混匀。取出 2.0 mL 混合液至另一个 100 mL 烧杯中，加入 10.0 mL 碘稀释液和适量的水，混匀

38、后置于 20水浴中，用 1 cm 比色皿在波长 575 nm 处，以 4.3.1 所用溶液为参比，测其吸光度。调整加水量，使测得的吸光度在 0.550.60 之间，如果测得吸光度大于 0.60 则增大加水量，如果测定值少于 0.55 则减少加水量。通过反复试配，直至测定的吸光值在 0.550.60 之间，记下此时的加水量（V 0） ，并用它调整空白溶液的加水量， V0 即为该 -极限糊精测试时的加水量。4.3.3 提取称取谷物样品约 5 g（精确到 0.05 g） ，倒入 300 mL 锥形瓶中，加入预热到 30的氯化钙溶液 100 mL0.5 mL，充分摇匀，置于 30的恒温水浴中。在 15

39、 min、30 min、45 min 时从水浴中取出，上下点到锥形瓶 10 次，重新置于水浴，共提取 60 敏。取出锥形瓶并过滤，滤液即为 -淀粉酶的提取液。4.4 活性测定将 -淀粉酶的提取液和 -极限糊精溶液置于 30水浴中预热，10 min 后用快速移液管吸移 5.0 mL-极限糊精溶液至盛有 15.0 mL 酶提取液的锥形瓶中，加塞后摇匀。在加液的同时，用秒表计时。吸取 10.0 mL 稀碘溶液于各个 50 mL 容量瓶中，加入 V0 mL 水，混匀加塞后置于 20水浴中，每隔 5 min 或 10 min 进行下列操作：15 吸取 2.0 mL 酶、- 极限糊精混合液到一个盛有稀碘溶

40、液和 V0 mL 水的容量瓶中，摇匀后置于 20水浴中，使混合溶液温度达到 20； 倒入比色皿测其吸光度。4.5 结果计算试样的 -淀粉酶活性按式（1）计算：式中：A-淀粉酶活性，以 U（单位）计；m100 mL 氯化钙提取的试样质量，单位为克（g ） ；h试样中水分含量（以质量分数计） ，%；f酶提取液的稀释倍数；t1、t 2不同的反应时间，单位为分（min） ；D1、D 2时间 t1、t 2 时的吸光度；blgD 对 t 曲线的斜率的绝对值；500系数。4.6 精密度同一样试样，在同一实验室同时或连续两次测定结果之差，不得超过平均值的 10%，如果两次测定结果符合要求，则取结果的平均值。按

41、表 1 修约：表 1 结果表示方式活性/U（单位） 修约成整数范围/U（单位）50 0.150500 15005000 10500050000 100注 1：测定过程中应合理调整酶的浓度，使 35%60%的 -极限糊精在 15 min 内降解，即最后测得的吸光度为底物校准时吸光度的 40%65%。如果吸光度降得太快，则酶液可用 0.2%的氯化钙溶液再稀释。如酶的活性太低，为获得正确结果，可将反应时间延长到 60 min 以上。注 2：用分光光度计测定吸光度时，溶液温度对结果又影响，必须控温在 20。在 4.4 的操作中，从显色到测定吸光度的间隔时间一般对结果没有影响，如测定一系列样品，可16在

42、所以样品均完成显色后再一起测定测定吸光度。但最长间隔时间不得超过 1 h。5.饲用纤维素酶活力的测定：滤纸法 GB/T 23881-2009；5.1 试剂和材料本标准使用的试剂均为分析纯，水均为符合 GB/T 6682 中规定的二级水。 酒石酸钾钠（C 4H4KNaO64H2O）. 苯酚。 亚硫酸钠。 氢氧化钠溶液（200 g/L）：称取氢氧化钠 20.0 g，加 100 mL 水溶解。 柠檬酸溶液（0.1 mol/L）：称取柠檬酸（C 6H8O7H2O）2.10 g，加水溶解定容至 100 mL. 柠檬酸钠溶液（0.1 mol/L）：称取柠檬酸钠（Na 3C6H5O72H2O）2.94 g，

43、加水溶解定容至 100 mL。 柠檬酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH5.5）：称取柠檬酸（C 6H8O7H2O）10.5 g，加入氢氧化钠 5.0 g，再加 800 mL 水溶解，用柠檬酸溶液或柠檬酸钠溶液调节 pH 至 5.5，再用水定容至 1000 mL。 Whatman 1 号滤纸条（1.0 cm6.0 cm ） 。 DNS 试剂：称取 3,5-二硝基水杨酸 3.15 g，加水 500 mL 搅拌溶解，水溶至 45，然后逐步加入氢氧化钠溶液 100 mL，同时不断搅拌，直至完全溶解，再逐步加入酒石酸钾钠 91.0 g、苯酚 2.50 g 和亚硫酸钠 2.50 g，搅拌至溶解，冷却到

44、室温后，定容至1000 mL。过滤，取滤液贮存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放 7 d 后可以使用，有效期为 6 个月。警告：处理酸碱和配制 DNS 试剂时，应在通风橱或通风良好的房间进行，戴上保护眼镜和乳胶手套，一旦皮肤或眼睛接触了上述物质，及时用大量的水冲洗。 葡萄糖标准溶液（10.0 mg/mL）：称取经 105烘至恒量的无水葡萄糖约 1 g，精确至 0.0001 g，加柠檬酸盐缓冲溶液溶解，定容至 100 mL。5.2 试样的制备按 GB/T 14699.1 采样，按 GB/T 20195 选取样品至少 500 g，四分法缩减至 100 g，磨碎，通过 0.25 mm 孔筛，混合密闭容

45、器中，低温保存。5.3 测定5.3.1 试样溶液的准备称取 0.2 g4 g 试样，精确至 0.0001 g，加入 40 mL 柠檬酸盐缓冲液，磁力搅拌 30 17min，再用柠檬酸盐缓冲液定容至 100 mL，在 4条件下避光保存 24 h。摇匀，取 30 mL50 mL。以 3000r/min 离心 3 min。取 5.00mL 上清液，用柠檬酸盐缓冲液做二次稀释（稀释后的待测酶液中纤维素酶活性应控制在 0.04 U/mL0.18 U/mL 之间） 。液体样品可以直接用柠檬酸盐缓冲液进行稀释，定容（稀释后的酶液中纤维素酶活性应控制在 0.04 U/mL0.18 U/mL 之间） 。如果稀释

46、后的酶液 pH 偏离 5.5，需重新调节 pH 为5.5，用柠檬酸盐缓冲液稀释定容。5.3.2 标准曲线5.3.2.1 分别量取葡萄糖标准溶液 0.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL，分别用柠檬酸盐缓冲液定容至 50 mL，配成浓度为 0.00 mg/mL2.00 mg/mL 的葡萄糖标准系列。5.3.2.2 分别吸取葡萄糖标准溶液各 1.00 mL 于 25 mL 容量瓶中，各加 2.00 mL 和 2.00 mL DNS 试剂，沸水浴 5 min。冷却至室温，用水定容至 25 mL，在 540 nm 波长下比色，以吸

47、光度作横坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵坐标，列出直线回归方程。5.3.3 酶活性的测定5.3.3.1 吸取 10.0 mL 经过适当稀释的酶液，37平衡 10 min。5.3.3.2 在 25 mL 具塞比色管中加入滤纸条滤纸条须对称剪成 32 片并全部放入，加 1.0 mL 柠檬酸盐缓冲液浸润滤纸片，37水浴平衡 10 min，再依次加入 2.00 mL DNS 试剂，0.50 mL 酶液，5 mL 水，电磁振荡 3 s5 s，37水浴中保温 60 min（用秒表控制） ，然后在沸水浴中煮沸 5 min，冷却至室温，用水定容至 25 mL，在 540 nm 波长处测定校准值 A0。

48、5.3.3.3 在 25 mL 具塞比色管中加入滤纸条滤纸条须对称剪成 32 片并全部放入，加 1.0 mL 柠檬酸盐缓冲液浸润滤纸片，37水浴平衡 10 min，再依次加入 0.50 mL 酶液，5 mL 水，电磁振荡 3 s5 s。37水浴中保温 60 min（用秒表控制） ，加 2.00 mL DNS 试剂，然后在沸水浴中煮沸 5 min，冷却至室温，用水定容至 25 mL。在 540 nm 波长处测定吸光度 A1。5.4 结果计算5.4.1 试样中滤纸纤维素酶活性以 X 表示，单位为酶活力单位每克（ U/g） ，按下式计算：式中：X试样纤维素酶的活性，单位为酶活性单位每克（ U/g） ；m根据标准曲线方程上计算得的（A 1 A0）值相对的葡萄糖的质量，单位为毫克（mg） ；X=Mt1000nm18M葡萄糖的摩尔质量，180.2 g/mol；t酶解反应时间，单位为分钟（min） ；1000转化因子，1 mmol=1000 mol ；n试样的总稀释倍数。5.4.2 每个试样取两份试料进行平行试验，测定结果用其算术平均值表示，保留 3 位有效数字。5.5 重复性再重复性条件下的两次测定，所得结果的相对偏差不超过 20%。木聚糖酶活力测定方法木聚糖酶活性采用 DNS 法 29进行测定。DNS 试剂(3，5-二硝基水杨酸)：