1、第一章 实验室基本设备及常用试剂一、基本设备组织学实验室的常用设备，主要有观察组织标本用的显微镜及制作标本用的必要设备、工具等。（一）显微镜显微镜是观察组织结构的精密仪器。显微镜的种类很多，功能也各不相同：如相差、荧光、偏振光、倒置及暗视野显微镜等，电子显微镜更给组织学研究开辟了广阔领域。本章侧重介绍常用和透射光学显微镜的简单结构和光学部分。1.显微镜的结构 显微镜包括机械部分和光学部分。(1)机械部分1)镜座及镜柱 是支持和稳定整个镜体的主要部件，一般多用铸铁铸成。近年来多改用生铝铸造镜座，功能虽同，但其质轻不稳则不如较重的铸铁。2)镜臂 连在镜柱上短的弯曲部分，提取或移动显微镜时的把握处。
2、镜臂与镜柱间有活动关节（倾斜关节） ，可使显微镜向后做一定的倾斜，便于观察时镜筒角度适应座位的高低，但其倾斜角度不会使镜的重心偏移至稳定范围之外。3)载物台 为安置标本的平面台，呈方形或圆形，台的中心有一圆孔，可通过光线。台上附有一对弹簧夹，以夹持切片；或装有带刻度的推片器移动切片。4)镜筒 附于镜臂上端前方的圆筒，长度一般为 160mm。它是成像元柱的通道，镜筒上端装接目镜，下端装物镜转换器。5)物镜转换器 简称转换器，接镜筒下端，为圆盘状，有 34 个物镜孔。装物镜于转换器时，低倍、高倍至油镜依次以顺时针方向安装，便于使用。物镜孔的螺纹和口径是国际统一的，可换用任何国家生产的物镜。6)调焦
3、轮 又称调焦螺旋。调焦轮有两组，即粗调焦论和细调焦轮。旋转它们时，有的是调动镜筒，有的是调动载物台，调节焦距使物象清晰。粗调焦论调节范围较大，每转动一周可使镜筒或载物台升降 10mm 左右。细调焦论调节范围较小，每一周，镜筒或载物台上仅有 0.1 或 0.2 的升降。(2)光学部分1)接目镜（目镜） ，装在镜筒上端，其表面标有放大率 5（5 倍）10（10 倍） 、16（16 倍） 、20（20 倍） 、甚至 25（25 倍） ，近年各厂家生产的目镜多为平周（刻有 P 或 Plan 等字样） ，光视野（刻有 WF）等。2)接物镜（物镜） ，装在镜筒下端的转换器上，一般有 10、40及油浸镜（9
4、0100）等数种。10以下为低倍镜，40左右为高倍镜。一般常用的时消色差（Achromalic）物镜。还有较高级的复消色差（Apochromatic）物镜，成像质量更高，需要配合补偿目镜（Comensating）使用，但此类物镜质量很高，一般实验室不必购置。像的放大率物镜放大率。3)聚光器，装载载物台之下，它聚集反光镜所反射的光线，通过载物台的中央空透过标本。聚光器也有调节螺旋，可使之在一定距离内升降，从而调节光线进入物镜的聚散程度，有助于调节成像的景深。但当用油浸物镜时，聚光器必须开至顶端。聚光器内附有虹彩光阑，能随意开大或缩小以调节光线的强弱。显微镜在使用前必须先调好聚光器，一般都调整夹持
5、聚光器的螺丝钉。使聚光器的上平面恰好与载物台平面相齐。此外，它也附有装色片的片框。4)反光镜，为聚光器下方的圆镜，一面是平镜，另一面是凹镜。凹面在光线暗而弱时使用。2.显微镜的作用(1)安放显微镜 显微镜自镜箱中取出时，右手持镜臂，左手托镜座，轻放在实验台上，靠近自己身体前略偏左侧。距实验台的边缘不要太近以免掉落。(2)调焦 转动粗调焦论使镜筒略微上升，先降低倍镜转到位，用左眼注视目镜，依次调节反光镜、聚光器和光栏，至视野的光度适宜为止。将玻片标本放置载物台上，正对载物台上的圆孔，注意使有标本的一面朝上，转用低倍物镜，一面用左眼（不要闭上右眼）在目镜中观察一面用左手移动标本，用右手转动粗调节轮
6、，直至找到观察目标并调节成像清晰为止。低倍镜视野较大，成像倍数低，观察时便与了解标本的全面情况。如要观察标本中某一部分的细微结构，则需用高倍镜。此时，将要看的部分移至视野正中，再转换高倍镜，一般显微镜如已调好低倍镜，只要转换高倍镜，焦点即已调整得相当完好 ，此时，只使用细调焦轮调焦既可。油浸镜在观察更微细的结构时使用。使用时要先在玻片上加油剂（专供油镜用的香柏油或其他合成剂） ，将有镜转到位后，慢慢调至油镜的下镜片正浸入油剂为止。用细调节轮调焦。观察完毕后用擦镜纸沾二甲苯将有镜内影响镜片的牢固度。(3)收藏显微镜 显微镜使用完后，应将显微镜各部件还原并放入境箱中保存。3.注意事项显微镜是一种结
7、构精密的仪器，在使用时必须十分小心。(1)一般在显微镜箱内放置防潮矽胶，定时更换以保持干燥，防止光学部分长霉及金属部分生锈。较高级显微镜的目、物镜长期不用时，应取下并保存于干燥器内。显微镜的光学部分，不可用手指、粗毛巾或纱布擦拭，必须用擦镜纸或绸布、绒布轻轻拂拭。其机械部分可以用纱布擦拭。(2)显微镜不得暴露于日光下，避免与酸类、碱类和其他有腐蚀性试剂接触。(3)应用显微镜，宜放于一定位置。用毕即时擦去镜伤污物及灰尘，盖上玻璃罩或塑料罩防尘。(4)粗、细调焦轮必须经常转动，保持灵活。不应有打滑、滞涩现象。如果发现对准焦点后，映像逐渐模糊不清，说明镜筒或载物台有滑动现象，应立即检修。一般地被观察
8、时用粗调节轮，高倍及油井观察时才用细调节轮。(5)显微镜的任何零件不得随意拆卸，尤其是物镜，应避免拆卸擦洗。（二）切片机切片机可将各种组织切成数微米厚的薄片，以便于精简。切片机一般分三种类型：即旋转式、滑动式及冰冻式。这三种切片机均备有三组部件：固定切片刀的刀架。夹持组织快的夹具。推动组织块夹具的微动调节器。不论是哪一种切片机，上述三组部件都安装在牢固稳定的切片机身上。1.旋转式切片刀所谓“旋转式切片机“是靠旋转一个重轮，带动螺纹轴或齿轮，将组织块夹具向前推进，并在上下平面摆动；推动的距离靠一个有刻度的调节器控制。夹具每上下摆动一次，即向前推动此调节器，可控制组织块按需要调节一至数十微米（um
9、） 。在组织块夹具前即为切片刀的刀架。所以在使用螺旋式切片机时，一般是先把组织块夹紧，再将调节器调至要切的厚度，然后锁上螺旋重轮使不能转动，以免在装切片刀是误伤操作者。此时，再将切片刀在刀架上旋紧，使其不能有任何摆动，然后将刀架慢慢向组织块夹具，直到刀刃恰能触及包埋组织的蜡块为止。放开卡锁，旋转重轮即能按所需要厚度切片。切片时，通常是先将厚度调节器调到切片较厚的读数（如 20um） ，待组织块切块较完整的平面时，再调至所需要的厚度（7um） 。2.滑动式切片机滑动式切片机多用于切火棉胶切片，故又称火棉胶切片机。他常用于制作大块标本，囊装器官和易于塌陷的组织切片。滑动式切片机根据台座的不同，又可
10、分为“斜面式“和垂直式”两种类型。无论哪种类型，都是组织夹具不动而靠滑动切片到来切片。斜面式滑动切片机 靠切片厚度调节器在一斜面上向上推动组织块夹具，切片刀则作水平滑动，经过组织块夹具上方，每次按一定厚度切下组织切片。切片刀的高度、倾斜度以及与滑动平面所成的角度，在刀架上都能调整。组织块夹具也有各向的螺钉调节组织块的高度、倾斜度及角度。做火棉胶切片时，切片刀一面凹一面平，凹面向上，以便盛溶 70%酒精，利于切下完整的大块组织。 垂直式滑动切片机 原理与斜面式相同，但其组织夹具使组织块垂直上升，然后将刀在滑轨上滑行切片。设备较好的滑动式切片机，切片刀每滑动一次，即可借以联动机构传动调节器按所需厚
11、度升高组织块夹具，从而使下一次切片时不必再调东厚度装置，即所谓“自动调节 。3、冰冻切片机这并非特殊类型的切片机，只不过组织块承托台改换成急速冷冻（约零下2030）装置。这种急速冷冻装置可以有两种形式：一为通过液体 CO2，在液体 CO2蒸发时，急速吸收大量热而使组织块很快冷冻。另一种维半导体致冷装置，借半导体元件电偶作用急速使组织承托台降温，在2 分钟内也能达到组织冻结的目的。须注意的是，制作冰冻切片时，不但要使组织块冷冻，同时还应是切片刀冷冻（如利用喷散的多余液体 CO2或半导体致冷装置使刀降温） 。这两种冷冻装置以半导体冷冻装置使用方便，但需电源和水源。（三）冷冻切片箱（Cryostat
12、）实际是将一个旋转式切片机装在低温冰箱内，切片机的转轮及手柄装在箱外右侧，切片时通过观察操作可获得较薄的冰冻组织切片。这种设备适于作组织化学切片。（四）磨刀机磨刀机一般分为两大类：一类为圆盘式，切片刀固定在可调的刀架上，靠机械定向的推动，在一块打毛了的圆盘状厚玻璃上磨（需加很细的磨砂） ；刀架也有能翻动刀的，更为方便。另一类为磨刀式，一块圆筒形的磨石，在一轨道上前进并按一定的方向自转；切片刀架在可调性的刀架上，磨石转动前进，而刀不动；磨到一定时间再将刀反面磨。目前用于旋转式切片机（包括冷冻切片箱）的切片刀，可改用“安全切片”，由一套刀片夹具，加紧一片单面刀片进行切片。由于刀片价格便宜，用一、二
13、次即可弃去换新片。不必磨刀。（五）自动脱水机当大量的组织块或切片需要用同一方法处理时，可用自动脱水机来完成。它的构造主要有以下几件：盛装组织块或切片的提篮，借以主轴升降并转动一定角度。可装脱水剂（酒精、二甲苯） 、石蜡及流水冲洗染色等的烧杯或搪瓷缸，这些烧杯都按一定顺序排列在一圆形台上。定时与马达传动装置。自动脱水机可用作组织块脱水透明基浸蜡等，或换成切片脱蜡、酒精、染色、脱水等过程。无论做哪一系列的组织处理，都应该先设计好该过程所经的各个阶段及所需的时间，然后在自动脱水的定时上定时，在各烧杯内装好试剂，并按顺序排好，最后再升将主轴的提篮内装组织块或切片， ，开动机器后即能按需要定时操作。精密
14、自动脱水机的定时设计比较复杂，传动部件运动灵活，不易发生故障，适于在工作量较大的实验时使用。（六）恒温箱与干燥机恒温箱式切片室不可缺少的设备，主要供浸蜡、烤片、培养及孵育等之用。“隔水式电热恒温箱“，除有电炉丝及金属外壳外，四周有水箱，利用水箱内的水温，传导至内室，将箱温升高。温度上升下降的幅度，较电热是恒温箱慢。其主要优点是保温时间长，温差变化比较小，也比较安全。此外，变可自制简易灯泡电热恒温箱，做一个长 5067cm、宽1724cm、高 43cm 的长方形木箱，在木箱顶端内面安装四个 60100W 的灯泡，外面各安装 1 个电灯开关，内置 0100温度计 1 支。开始使用时，可先将 4个灯
15、打开，如温度过高，则酌情关闭 12 个灯炮。为了安全及保持温度恒定，可在木箱内面铺一层石棉。这种温箱的优点主要是热源在顶端，热自上而下逐渐辐射、扩散，对浸蜡较为有利。另一种灯泡电热熔蜡箱更简单，用铁支柱架的铁夹将带盖的灯泡夹住（盖子直径为 20cm,灯泡为 60100W） ，制一个两端开口的马口铁圆筒置于灯泡下，圆筒高 20cm、直径 21cm，木质底，在其上面放置一个能旋转的木盘（直径为20cm） ，马口铁的圆筒就罩在四周，熔蜡杯放于圆盘上。如需取蜡杯，可旋转木盘。在圆筒的一边开 10cm 见方的小门。电灯的上升与下降可调节其温度，最好与圆筒与灯罩之间为一圈纱布，以防灰尘落入。用作熔蜡的恒温
16、箱最好准备两个，一位高熔点浸蜡箱，温度调至 60左右，用于浸蜡及熔解包埋蜡。另一为低熔点浸蜡箱，温度调至 4550之间，用于浸软蜡。用于组织培养、胚胎孵育、某些特殊染色标本（如高尔基法的镀银过程）和某些组织化学标本时，温箱的温度一般调至 3740左右，可按具体要求进行调节。干燥箱的结构基本和恒温箱一样，但其升温范围较大，可从室温升至200以上，还可有鼓风装置。主要用于烘烤箱洗后的玻璃器皿及某些需要加温 60以上时应用。（七）冰箱切片室也需要设备冰箱，特别是开展组织化学以及染色体技术时，更需冰箱用于保存染液、试剂和药品并提供切片用冰。一般家用冰箱即可。（八）离心机离心速度 10004000 转/
17、分即可，可供脱落细胞及染色体技术用。（九）天平应有两种天平，即一般用的药物天平，容量 500g，1/10g 感量即可；在备一 1/1000g 感量的分析或扭力天平供组织化学等较精密称量用。（十）酸度计开展组织化学及染色体方面的工作，pH 要求较为严格，应设备酸度计。（十一）定时钟为切片室的常用设备。染色、脱水、透明、浸蜡等，均需定时，故需用定时钟。有机械定时钟及电动定时钟两种。暗室用定时钟，钟面的数字及指针以发荧光为好。（十二）一般手术器械及维修工具常用手术器械如解剖刀、手术刀、刮须刀片（单面） 、手术剪（圆头、半圆头、尖头） 、眼科剪（弯、直两种） ，各种不同长度的有齿镊及无齿镊、眼科刀、拔
18、针、金属铲、咬骨钳、骨剪、弯锯、持针器、止血钳、截肢刀以及普通剪刀等。此外，实验室还应备有台钳、大小螺丝刀、鲤鱼钳、活动扳手以及电烙铁等修理工具。（十三）木器设备1.切片柜 放置已经制好的各种切片，一个切片柜最好能储存一百种左右的切片，采用齿槽抽屉式，可以防止切片柜彼此粘连。另外也有装标本盒的切片柜，每格的大小按切片盒的尺寸制作，每柜以装 100 个标本盒为宜2.蜡块柜 各种存档备用蜡块，除用纸制蜡块袋（盒）分装外，应置蜡块柜里贮存。一般采用活动分格抽屉式。3.药品柜与器械柜 这类柜以分上下两层结构为好，上层为多层式（34 层）的玻璃滑门柜，放置染液、试剂、药品及器械等物。下层为带有抽屉的木制
19、滑门柜，放置托盘、电炉、酒精等及其它用品。4.工作台 放置切片机、显微镜、恒温箱、天平以及酸度计等，工作台可制成长方形，沿窗口安置，用木或水泥制作。放置分析天平的工作台则以水磨台或加瓷砖面为宜。5.药品架 以台阶式顶端有木板遮盖者为好，一般为 6 层左右，放置常用的染液、职级、酒精及二甲苯等。6.切片盘柜 体积不宜过大，能放置 48 片木质盘即可，以分格式从上倒下约 1012 格为宜，每格装切片盘三个，用于存放新制出的切片。7.切片盒 贮存制成的切片，规格有 100 片装，501 片装以及 25 片装等。（十四）染色缸与染色架染色缸有两种，一种是 10 片装染色缸，亦称卧室染色缸；另一种是 5
20、 片装染色缸，亦称立式染色缸。缸内两端有槽，可隔开切片以免两片相粘。载玻片染色架，亦可作烤片架用，是用铜或铝作成齿槽状的方形架，大小式样，按需要而定。大型的长 27cm，宽 8cm、高 23cm，从两侧长度的内面各镶 3050 齿格，每格放在玻片 1 张，每架共装载玻片 3050 张。架子的两端装有铜制或铝制的提柄，便于提起。盖玻片染色架，如大量进行教学制片，也可采用盖玻片染色法。可按照各种盖玻片的规格制成不同的染色架。如用 1818mm 盖玻片，则染色架长7.7cm、宽 2.2cm、1.8cm。每一小架均有 30 齿格，一次可载染盖玻片 30 张（架的大小也可按染色缸的大小相应设计） ，架的
21、一端装有提柄，便于提取。为能一次染更多的切片，可另作铜质染色框架，长 16cm、宽 8.3cm、高 2cm，两端装有铜提柄，每框架可装小架 7 个，共装切片 210 张。(十五)载玻片与盖玻片常用载玻片的大小为 2575mm，厚 0.81.2mm；过薄过厚都不方便。神经切片及胚胎连续切片则比上述规格为大，有时需特殊订货。常用的盖玻片为边长 1824mm 正方形或 2224mm 长方形，特殊用的盖玻片可生产单位订货。另外，还有用于荧光显微技术的石英玻片。组织培养时，需用单及双凹玻片制作“悬滴标本“。新的载、盖玻片必须经清洁液处理后方能使用，方法是先用自来水冲洗或洗衣粉擦拭冲洗后，再入清洁液浸泡一
22、天以上，取出经清水冲洗，转入 95%酒精内浸泡脱脂后，用干净的棉布及绸布擦干备用，一般玻璃仪器可放入干燥箱内烤干备用。经染色并封片后的载玻片，可现在酒精灯上加温以除去或放入大量废二甲苯浸泡一周作左右，盖玻片既能与在载玻片自然分离，然后投入碱皂税种煮沸，经自来水冲洗后，按新玻片处理法处理。这种用废二甲苯使该玻片自然脱落的办法，可用来处理需要重染的切片。盖玻片脱落后，切片经各级浓度酒精下行至水，即可再染色。（十六）常用玻璃器皿广口瓶 规格为 301000ml。无色透明的 50250ml 广口瓶用得最多，用于组织的取材、固定、脱水、透明等。棕色广口瓶用于组织块镀银以及装某些必须避光的试剂。小口瓶 规
23、格为 10010000ml，用于配制固定液、染色液、装蒸馏水、95%酒精等。还应有几个 10000ml 的引流瓶。培养皿 直径有 6、9、11、15cm 等规格。小培养皿制作鸡胚标本用，中型皿用于火胶棉切片和制作冰冻切片标本。大型皿可用于肠系膜、消化管的固定等。量筒和量杯 规格为 51000ml。其他玻璃仪器由各种规格的锥形烧瓶、漏斗、烧杯、吸管、刻度离心管、称量瓶、标本缸、玻璃干燥器、表面皿、钟罩、乳钵、培养瓶、滴瓶、分液漏斗、细菌漏斗、玻璃棒以及玻璃管等。（十七）浸蜡及包埋用具酒精灯 用于加温包埋蜡（特别在冬季）及烧烤包埋尖镊等。浸蜡杯或浸蜡盒 一般搪瓷口杯或铝饭盒均可。浸蜡篮 按搪瓷口杯
24、或铝饭盒大小而制成的细铜丝分格网篮， ，用于多种组织块的同时浸蜡，有时也用于多种组织块的脱水与透明。包埋夹镊 用于夹取金拉的组织块。包埋器 “L“形两块，铜或铁制，用于制作石蜡组织块。也可以 5 片染色缸的玻盖或用纸折叠，见“包埋“章节。（十八）其他切片用具1.切片镊 又名摊片镊，一向用弹性较好的弯头尖镊，以不锈钢制品为好，市售的弯头牙科镊亦可。用于摊片和蜡带的分离。2.毛笔 在石蜡切片时用于挑起、铺平蜡片及蜡带，或挑起、压平火棉胶切片。3.钻石笔 在载玻片上刻字标记。4.摊片器 将装水后的摊片铝盘或培养皿制铁三角架，再用酒精灯加温；亦可将弹簧反光灯制铝盘下加温。另有用电做热源的，一种是用电炉
25、丝使温度保持在 4555；另一种是在长方形木箱内装电灯泡，虽使用方便但不经济。5.托盘 又木制和金属品两种。规格有 24 片装，36 片装和 48 片装等。还有其他规格，如 20 片装有盖托盘，既可用于存放蜡带，又可用于染色的切片保存。6.蜡带摊片器 用于连续切片。现将切下的蜡带贮存于托盘中，再按顺序进行摊片。蜡带摊片器位铜质金属板结构，面积为 2030cm 下有 4 个 18cm 高的金属脚，金属板下焊有一个 1285cm 的水箱用酒精灯给水箱加温均匀上升，这时，再将涂有蛋白甘油的载玻片置于金属板上，滴水进行蜡带摊片。7.其他用具均视需要而定。二、常用试剂组织学中常用试剂较多，现将主要试剂简
26、介如下。1.蛋白甘油 取新鲜鸡蛋，先将其尖端用眼科剪或拔针挑破一小孔，再在鸡蛋的另一端挑破一小孔并稍加扩大，大孔端朝下，使蛋白流入 100200ml的烧杯中（不要蛋黄） ，以玻璃棒打搅蛋白完全变为雪花庄泡沫，然后倒入等量甘油，振摇使之充分混合，加入 1%麝香草酚或樟脑防腐。一般将其盛入滴瓶或树胶瓶中备用，不用时盖好防尘。2.盐酸-酒精 作分色用。多采用 0.5-1%的浓度，即在 100ml 的 70%酒精加入 0.5 或 1ml 浓盐酸。3.石炭酸-二甲苯 作火胶棉切片脱水用。在温度较高的情况下，亦可作HE 染色的石蜡切片脱水用。石炭酸以白色透明结晶为好，如已氧化则呈红色，效果较差。石炭酸与二
27、甲苯之比为 1：3 或 1：4，即 30ml 二甲苯与 10g 石炭酸混合或 40ml 二甲苯与 10g 石炭酸混合。4.碳酸锂饱和液 取碳酸锂 2g 或稍多一点，置入 100ml 的蒸馏水中，是一种弱碱性液。5.碘酒 取碘 5g，溶于 95%酒精 80ml。再加入 20ml 蒸馏水即成。6.Lugol 碘液 为碘和碘化钾溶液，其浓度不一，即 100200ml 蒸馏水中加入碘 1g、碘化钾 2g。7.苯胺水 系苯胺油与蒸馏水的混合液。取苯胺油 5 份与蒸馏水 95 份混合，充分振荡，过滤即成。新配制的苯胺水，往往有沉淀，故应静置 24 小时后方能使用。8.生理盐水 取化学纯的氯化钠 0.85
28、或 0.9g 溶于 100ml 蒸馏水即成。此为哺乳类温血动物用生理盐水。两栖类动物用的氯化钠溶液浓度为 0.64%，鸟类用的为 0.75% ，海生动物为 1.52.6%。9.Ringer 液氯化钠 0.9g，氯化钾 0.042g，氯化钙 0.025g，蒸馏水 100ml。上述配方为温血动物的，如将氯化钠的量改为 0.65g，既可作为冷血动物用的配方。10.Locke 液氯化钠 0.85g，氯化钾 0.042g，重铬酸钾 0.02g，氯化钙 0.024g。依上述次序，溶入 100ml 蒸馏水中。冷血动物用，氯化钠改为 0.65g。11.升汞饱和水溶液 将 7g 或稍多的升汞加入 100ml 蒸
29、馏水中即成。注意，此为剧毒药物，需由专人保管。12.清洁液（洗液）重铬酸钾（工业品纯） 300g 浓硫酸（工业品纯） 300ml 自来水 3000ml实际上重铬酸钾、硫酸与自来水之比为 1：1：10。先将重铬酸钾溶于水，如加热须待冷后，在缓缓加入浓硫酸，边加边搅。不准将水倒入浓硫酸内！另外，清洁液只能用于玻璃仪器的清洗，不能浸泡金属器械。95%酒精稀释成各级浓度酒精简表95%酒精毫升数 加入蒸馏水毫升数 所的酒精的浓度94.789.784.25.310.315.890%85%80%79.073.668.463.157.952.647.342.136.831.526.321.015.710.52
30、1.026.431.636.942.147.452.757.963.268.573.779.084.389.575%70%65%60%55%50%45%40%35%30%25%20%15%10%13.酒精稀释液 商品酒精的浓度有两种，一种为无水酒精，另一种为 95%酒精，实验室中配制不同浓度的酒精，多有工业用 95%酒精稀释使用。不同浓度的酒精稀释法有三种：最简单的稀释法，是将被稀释的酒精用酒精比重计测量，这种测量受气温的影响，夏天与冬天可能有 5%的误差。如将 95%酒精稀为 70%酒精时，可取 70ml 的 95%酒精加水至 95ml 即成，余类推。第二章 杀死取材及固定组织学教学切片，常
31、要取材于动物的组织，科研组织切片更是如此。现就如何处理动物，介绍如下。一、 动物致死法1.麻醉法 可将浸有乙醚或氯仿的棉球连同小动物一起密封于钟罩或玻璃瓶内进行麻醉。也可用 4% 戊巴比妥做静脉注射，剂量一般按动物体重每公斤1ml；或用 20% 氨基酸乙酯（尿烷或乌拉坦）作腹腔注射，剂量一般按动物每kg5ml。2.空气栓塞法 如兔可用 50ml 注射器将空气有耳静脉推入，使动物很快死亡。3.击头法 如大、小鼠等小动物，可用重物猛击后头部或将其头后部猛撞桌沿，最好一击而死，4.断头法 青蛙、小鼠等小动物可用剪刀剪去其头部，如反射尚未消失，则可用探针插入椎管中，破坏脊髓。较大动物如兔等，可用斧头迅
32、速砍头致死。5.股动脉放血法 动物经吸收乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切开股动脉放血。上述各法，应根据制片需要选用，如空气栓塞法，不宜用于血管注射标本的制作；乙醚麻醉对丘脑下部神经分泌物的染色标本不利；股动脉放血法有利于肠系膜铺片的制作。无论何种致死法，都要求动作迅速，因为动物一旦死亡，其组织与细胞及开始自荣。组织学检查，特别是细胞学观察，要求材料新鲜。二、 取材注意事项1.材料新鲜 最好是动物的心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内，脏器的上皮组织最易变质，应争取在收半小时内处理完毕。2.组织块力求小而薄，教学与科研使用的组织块厚度以不超过 5mm 为宜，较理想的厚度为 2mm 左右。不仅要考虑厚度
33、，而且其长度与宽度，在可能范围内也应力求短小。以使固定液能迅速而均匀的渗入组织块内部。3.勿使组织块受挤压 切取组织块用得刀剪要锋利，切割是不可来回挫动。夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损伤组织、细胞。取材时，组织块可稍取大一点，以便在固定后，将组织块的挤压或损伤部位修去。4.尽量保持组织的原有形态 新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形；神经、肌肉组织等，则可将其两端用线扎在木片或硬纸片上固定。5.要熟悉取材的部位 要能准确地按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的胰腺尾部；脊髓取腰膨大与颈膨大处；肺应取有细支气管既带有软骨片的小支气管部
34、位等。6.动物品种的选择 如观察肥大细胞，以大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜铺片为佳。内耳与胰岛细胞的观察，多取材于豚鼠。欲观察运动终板，可用小鼠的肋间肌等。7.选好组织块的切面 熟悉某些器官的组织成分安静，然后决定其切面的走向；纵切或横切往往是显示组织结构明晰的关键。如一长管状器官以横切面较好。8.保持材料的清洁 组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用生理盐水冲洗，然后再入固定液，但要注意防止组织损伤。9.切除不需要的部分 特别是组织的脂肪等，应尽可能清除掉，否则将给固定、脱水、浸蜡、切片等带来一些不必要的问题。三、 固定固定是组织学制片的重要步骤。即使取材很好，若固定不当，也得不
35、到好的切片。（一） 固定的方法1.蒸汽固定法 比较细小而薄的标本，可用锇酸或甲醇蒸气固定。主要用于血液活细胞涂片以及某些薄膜组织等的固定。如血液涂片，则应在血片未干燥前就余锇酸蒸气接触。具体操作时，应先准备有该培养皿一个，其中滴入12%锇酸水溶液 23 滴，将血液涂片放置其中。固定 30 秒钟至 1 分钟左右，立即水洗后进行染色，然后封片或其它保存处理。2.注射、灌注固定法 某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个动物进行固定。这时宜采用注射固定法，将固定液注入血管，经血管分枝到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。局部灌注固定 如肺可将固定液从气管或支气管注入，注入速度不宜太快
36、，用力要均匀，注入量要适当以免胀破肺泡。眼球则可从眼后房注入固定液。肝、肾等脏器则可从肝、肾动脉注入固定液，同时，切断其静脉以便血液排出，使固定液充分浸入。脑的固定，须在动物麻醉后，暴露颈动脉，此时以注射针尖向着头部的方向注入固定液，液体的出口可开在颈静脉或左心房上，如忘记了这一点，注射时血管就会由于内部压力增高而破裂。有时在固定液注入之前，先注射生理盐水洗至无血色为止。 全身灌注固定 较大动物如兔、猫、狗、猴及整个人体，往往采用输液方式，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血，即输入固定液与放血同时进行。固定液输入量，因个体不同而异。兔、猫约为5001000ml，猴、狗约为
37、 10002000ml。固定液输入后，可不必即可取材。有些小动物，如大、小鼠，在吸入乙醚深度麻醉情况下，可大开其胸膛，纵向切开心包膜，并在纱布再动脉弓下打一松结，然后用 50ml 注射器，选用适当针头，从左心室向主动脉方向刺入，针尖刺入后，勿使其移动，随手将纱线扎紧固定，再在右心房开一孔放血。一般先用于该动物等温的生理盐水徐徐注入血管中洗涤，待流出的液体不见血色时，再将固定液注入，至固定液完全分布全身为止。无论局部灌注固定，还是全身灌注固定，在灌注完成时，必须将组织块、器官或整个动物再放入同样的固定液中进行固定。3.小块组织固定法 从人体或动物取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，这
38、是应用最广泛最经常的方法。（二）固定的目的1.迅速阻止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败，使之尽量保持生前的状态与结构。2.使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持其原有状态。3.使组织内各种物质成分产生不同的折光率，以便染色后易于鉴别和观察。4.使组织块在脱水、包埋、切片、染色等过程中不易损坏。5.使组织成分对染料有不同的亲和力，经过染色处理后易于辨认。6.防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。7.使组织块硬化，便于制作薄片。（三）注意事项及影响固定的因素1.组织块不宜过大，一般以厚度 5mm，长宽不超过 1515mm。2.固定液的量一般以组织块大小的 20 倍为
39、宜，最好在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层滤纸，以便固定液能从上下左右前后渗入组织块。3.必须选择渗透力强，又不是组织过度收缩或膨胀的试剂作为固定液。4.有的固定剂是由氧化剂与还原剂混合而成，看来似不甚合理，但由于习惯及效果，现在沿用下来了，如甲醛（还原剂）与重铬酸钾（氧化剂）混合成Helly 液等。5.固定时间的长短使固定剂的不同要求而定，也与气温、组织块的大小有关。温度高则时间缩短，组织块大则应延长固定时间。6.软组织或较大块组织可先经 23 小时固定后在修整成小块重投入新配制的固定液内继续固定。7.特殊要求的组织，常需特殊的固定液，所以，取组织之前应做好准备。如各种神经组织因显示内容不同，
40、需不同的固定液与固定方法，等等。（四）固定剂浸入组织深度参考表（Culing，1974）（兔肝，室温）浸入深度（毫米）4 小时 8 小时 12 小时10%乙酸5%三氯乙酸10%甲醛95%乙醇7.5%升汞苦味酸（饱和溶液）2.5%重铬酸钾0.7%铬酸4%锇酸3.82.72.71.72.01.01.00.60.35.04.04.73.53.01.51.51.00.55.05.05.05.03.51.751.751.20.7(五)固定液固定液分两大类，一类是单纯固定液，即只是一种试剂；另一类是混合固定液，由两种或两种以上的试剂组成。作为较好的固定液，应有下列特性，首先，有较强的渗透力，能迅速的渗入组
41、织内部；其次，不是组织过度收缩或膨胀，并能使组织内欲观察的成分的伊凝固为不溶性物质；最后，能使组织达到一定的硬度并获得较佳的折光率和对某种染料具有较强的亲和力。1.单纯固定液(1)酒精 又名乙醇（C 2H5OH） ，它既是配制混合固定液的基本成分，又可作为单纯固定液使用。由于酒精时还原剂，故不能与氧化剂铬酸、重铬酸钾及锇酸等混合配成固定液。用于固定时以 8095%的浓度为好，它具有固定、硬化、脱水等多种作用。其渗透力较弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，但核蛋白被沉淀后，仍能溶于水。故经酒精固定的组织，核的着色不良，不宜于染色的固定。50%以上浓度的酒精能溶解脂肪、类脂、血红素及其他色素。高尔基
42、复合体、线粒体的固定，都应避免用酒精。其缺点是，经酒精固定的组织容易变硬，对组织收缩较大，一般比原组织缩小约 20%。做单纯固定剂时，多用于组织化学中的糖原固定。酒精的混合固定液见后。(2)甲醛（HCHO）水溶液 甲醛是一还原剂，为无色气体，他极易挥发且有强烈的刺激性气味。它在水中的饱和量为 3740%，甲醛水溶液即市售的福尔马林。常用的福尔马林浓度为 10%，这是指以 10ml 的商品甲醛（3740%甲醛水溶液）加入 90ml 的水配成的，此实际上只有 4%的甲醛，习惯用法常指这种浓度。甲醛水溶液渗透力强，固定均匀，对组织收缩较小，多用于大块组织固定，如全脑或手术大标本等。但经酒精脱水，石蜡
43、包埋过程中，显然强烈收缩。经它固定的组织，细胞核的染色优于细胞质。经它长期固定的组织，需经 2448小时的刘水冲洗，否则会影响染色效果。甲醛水溶液受温度、日光等作用，能产生少量的甲醛而呈酸性，其 pH 值可在 3.14.1 之间，这样就会使固定的组织块嗜染酸性，严重时，可影响细胞核内嗜碱性物质染色。为了中和它，在配制固定液时，可用自来水代替蒸馏水，也可用碱性物质予以中和，即在甲醛水溶液中，投入足量碳酸镁或碳酸钙，加强振荡后放置 24 小时，取其上清夜滤过使用。不过，中和后的甲醛水溶液久存仍易变为酸性，故用缓冲液保持中性pH7.0 较适用。甲醛水溶液必须无色透明，若逐渐变为混浊，甚至形成高度聚合
44、的白色胶状沉淀物（三聚甲醛） ，表示已变性，不宜再用。长期固定于甲醛水溶液的标本，能产生暗褐色的结晶样沉淀，多沉着于充血、出血及血液溶解的组织中，是为“福尔马林色素“或“福尔马林沉淀“。这种色素在肝、脾较为多见。该色素不溶于水、酒精、二甲苯、甘油、丙酮、脂肪溶剂及稀酸中，且影响染色效果。可用以下各法将色素除掉。氨-过氧化氢水溶液浸泡法 将未然色的切片，浸泡于 3% 过氧化氢水溶液 25 毫升内，加浓氨水 1 滴，12 小时后，经充分水洗再染色。氨酒精浸泡法 将切片浸泡于 25% 氨水 1ml、75%酒精 200ml 中，10分钟后，水洗染色。碱酒精浸泡法 将切片浸泡于 1%NaOH（KOH）m
45、l、75%酒精 100ml 中，10 分钟后，水洗染色。1)甲醛生理盐水液3740%甲醛液 100ml,氯化钠 8.5g，自来水或蒸馏水 900ml。2)中性 10%甲醛液3740%甲醛液 100ml，水 900ml，碳酸钙或镁足量。3)中性缓冲甲醛液（pH7）3740%甲醛液 100ml，水 900ml，磷酸二氢钠（水）4g，磷酸氢二钠（无水）6.5g。4)蔗糖甲醛液（Lillie）3740%甲醛液 10ml，乙酸钙（水）2g，蔗糖 30g，蒸馏水加至 100ml。有防止细胞内某些成分扩散作用。在 25，固定 1824 小时，然后流水洗去所含蔗糖。(3)升汞 又称氯化汞（HgCl 2）,为白
46、色粉末或针状结晶，剧毒，必须严格保管及注意使用。通常蛋白质沉淀，但对类脂及碳水化合物无固定作用，升汞的穿透速度快，对组织有一定的收缩作用，故常与冰醋酸、铬酸盐及甲醛等混合使用。用升汞固定组织后，需脱汞处理，方法有：组织专用脱汞法 组织固定后经刘水冲洗，逐级转入 7080%的酒精中，再加入少许酒精，待棕色消失后又继续加入，直至脱汞酒精呈极浅棕色为止。最后用 5%硫代硫酸钠水溶液去碘。切片脱汞法 切片脱蜡经下行酒精至 70%酒精，转入由 70%酒精配制 1%碘酒中，经 10 分钟左右，再用 5%硫代硫酸钠水溶液去碘。经升汞及其混合液固定的组织，能较好的显示细胞核。用卡红、沙黄、苏木精等染色都很好。
47、染色质能强烈的被碱性染料着色，而细胞质的结构也能被酸性染料与碱性染料着色。(4)醋酸 又名乙酸（CH 3COOH） ，为带有刺激性酸味的五色液体。纯酒精在 10以下结晶如冰，故称冰醋酸。在冬季须加温溶解。能与酒精、水、氯仿等多种试剂混合，故为许多混合固定液成份之一。它虽不能凝固细胞质中的蛋白质，但能使细胞核内的蛋白质得以沉淀，故对染色质或染色体的固定于染色都很好。它既不能保存糖，又不能固定脂肪及类脂，因此，在固定线粒体及高尔基体时忌用高浓度醋酸，若不得已而使用时，也只用 0.3%以下的浓度。醋酸对组织的穿透速度很快，故定小组织块仅亦小时即可。它对组织和细胞有膨胀作用，且不能凝固细胞质中的蛋白质
48、，因而不会使组织块硬化，所以常与酒精、甲醛水溶液、铬酸等易引起组织硬化与收缩的液体混合使用，以达到相互平衡的目的。(5)苦味酸 又名三硝基苯酚，为鲜姜色无臭结晶，干燥时极易燃烧，为安全和便利起见，通常以饱和水溶液贮存。它在水中的溶解度为 0.91.2%，易溶于酒精（4.9%） 、氯仿、醚、苯（10%）及二甲苯中。苦味酸能沉淀蛋白质，对脂肪、类脂无作用，其酒精溶液能固定碳水化合物。它的渗透力较强，一般很少单独使用。固定后，细胞收缩明显，经酒精脱水和浸蜡包埋后收缩加剧，其收缩程度可达 50%左右。苦味酸固定的组织并不硬化，经酒精脱水后，其硬化程度增加不大。经苦味酸或其混合液固定者，一般不宜用火棉胶
49、包埋，因苦味酸有软化火棉胶作用。苦味酸有软化皮肤的作用，经含苦味酸固定液固定的有毛皮肤等组织，易于制作完整切片，无硬脆现象。苦味酸有溶化肌腱粘蛋白作用，用含苦味酸的固定腱组织再以苦味酸氯化钠水溶液（将 3g 氯化钠加入 100ml 的苦味酸饱和水溶液中）浸泡 3 天，石蜡包埋，则能制作满意的肌腱切片。用含苦味酸的固定液固定组织不宜超过 24 小时，时间过长对苏木精等碱性染料染色不利。经它固定的组织往往先黄色，有人主张流水冲洗，但多数人认为，水洗后易使结构膨胀，且结缔组织的排列也比较紊乱。固定后的组织块，应即转入 70%酒精中，经一定时间洗去苦味酸，为了加快其脱去黄色的过程，往往在酒精中滴入少量饱和碳酸锂水溶液或浓氨水。在一般情况下，并不需要将黄色全部除去，因为在随后的酒精脱水和二甲苯透明事业能除去黄色。苦味酸除用于固定外，还用作染色剂。(6)重铬酸钾（K 2Cr2O7） 又名红矾钾，为橙红色结晶颗粒或粉末，不溶于醇，其水溶液呈酸性反应，加热后分离为氧化铬与铬酸钾。为强氧化剂，不能于酒精等还原剂混合贮存，与甲醛混合时也不能久存，混合后一般经 1224小时即失去作用，他的穿透速度快，对组
