酶学第八章酶的别构效应.doc

1、1第八章 酶的别构效应本章中将讨论一些不符合米氏方程的酶动力学，即非双曲线动力学。有些影响酶活性的效应剂（包括激活剂和抑制剂）作用于酶活性部位以外的部位，通过酶分子构象的改变来调节酶的活性。这种效应叫做别构效应（allosteric effects） ，这种效应剂叫做别构效应剂，受别构效应剂影响的酶叫别构酶（allosteric enzyme） 。8.1 别构酶与代谢调节8.1.1 别构效应在代谢调节中的意义生物体内的物质代谢都是在酶的直接作用下进行的，要使物质代谢协调有序地进行，酶活性必须根据情况适时地改变。利用别构效应调节酶活性是各种酶活性调节方式中最迅速的一种，大多数代谢物的反馈抑制就属

2、于别构调节，也有一些代谢物可对代谢途径中的酶起别构激活作用。8.1.1.1 别构抑制作用反馈抑制可分为五种类型：A 线性通路中的反馈抑制一条途径的最终产物抑制途径中最初的酶活性。B 趋同通路中的反馈抑制为了有效地合成 D，要求 B 和 C 的浓度大致相等。当 C 浓度大时，对产生 B 的途径的最初的酶有激活作用；当 B 浓度大时，对产生 B 的途径的最初的酶有抑制作用。C趋散通路中的反馈抑制EC 和 ED 为两种同工酶，分别受 C 和 D 的反馈抑制。当 C 太多时，不仅抑制从 B 到 C 的第一个酶，而且抑制从 A 到 B 的2第一个反应两种同工酶中的一种，使得 B 合成的速率下降。B 的合

3、成不能完全停止，因为合成D 还需要 B。当 D 太多时情况相似。D顺序反馈抑制一条途径中有多个反馈抑制步骤。E协调反馈抑制需要多种代谢物共同作用才能发挥反馈抑制作用。8.1.1.2 别构激活作用当一种代谢物积累后，激活某些酶，从而加强别的代谢途径。如有氧呼吸旺盛时，ATP 大量合成，AMP 和 ADP 减少，由于 AMP 和 ADP 是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，因此异柠檬酸和柠檬酸浓度增高，柠檬酸能激活乙酰 CoA 羧化酶和己糖激酶，同时抑制 PFK（磷酸果糖激酶） 。激活乙酰 CoA 羧化酶可增强脂肪酸的合成，激活己糖激酶且抑制 PFK，可使 G-6-P 更多地进入磷酸戊糖途径，合成更多的 N

4、ADPH，供脂肪酸合成使用。8.2 别构酶的基本概念8.2.1 一个典型的别构酶 天冬氨酸转氨甲酰酶天冬氨酸转氨甲酰酶（aspartate transcarbamoylase, ATC）是嘧啶核苷酸生物合成途径的第一个酶（ UTP CTP） 。ATC 的活性受到 CTP 的强烈抑制，又受到 ATP 的高效激活（见下表） 。在对照、加 ATP、加 CTP 三种情况的S对 V 图中可以看出，对照呈 S 形曲线而不是双曲线；加 ATP 减小了反应的表观 Km 值，使曲线向双曲线靠近；加 CTP 增大了反应的表观Km 值，使曲线的 S 形更加明显。加 ATP 和 CTP 并不影响 Vm。3表 效应剂对

5、天冬氨酸转氨甲酰酶活性的作用为 了解释这种现象，研究者设想在酶分子中有两个分开的部位，一个部位与底物结合并催化反应，另一个部位是 ATP 或 CTP 等效应剂的结合位点。利用选择性修饰法修饰后一个部位后，ATC 的活性并不丧失，但对 CTP 抑制的敏感性下降，这种现象称为脱敏作用。选择性修饰实验证实了两个部位的设想。现在我们知道，ATC 由 12 条多肽链组成，2 个 3 亚基，3 个 2 亚基。根据对 ATC 的研究，得出了 5 点结论：1酶分子上有两个结合部位，结合底物并催化反应的部位叫活性部位，结合效应剂的部位叫别构部位或调节部位。2这两个部位能同时分别被底物和效应剂占据。3调节部位可与

6、多种效应剂结合，并产生不同的效应。4效应剂的结合影响酶分子的构象，从而影响酶的着底物的结合能力和催化能力。5调节部位的效应是构成别构抑制或别构激活的基础，而后两者又是代谢调节的有效方式之一。8.2.2 别构酶的协同效应协同效应（cooperative effects）也是多亚基别构酶的一个特征。我们把能与酶结合的底物、激活剂和抑制剂统称为配体，所谓协同效应是指当一个配体与酶结合以后，可以促进或抑制另一个配体与酶的结合。效应剂 抑制 %胞嘧啶 0胞嘧啶核苷 24胞苷一磷酸（CMP） 38胞苷二磷酸（CDP） 68胞苷三磷酸（CTP） 86嘧啶族尿苷三磷酸（UTP） 8鸟苷三磷酸（GTP） 35嘌

7、呤族腺苷三磷酸（ATP） 180（激活）48.2.2.1 协同效应的分类A同种效应和异种效应同种效应（homotropic effects）指的是一分子配体与酶结合后影响另一分子同种配体与酶的结合；异种效应（heterotropic effects）指的是一分子配体与酶结合后影响另一分子异种配体与酶的结合。B正协同和负协同一分子配体与酶结合后促进另一分子配体与酶结合叫正协同（positive cooperation） ，抑制另一分子配体与酶结合叫负协同（negative cooperation） 。同种效应一般是正协同；异种效应有正协同，也有负协同。8.2.2.2 协同效应的鉴别方法通过动力学

8、作图，可以鉴别正协同、负协同和无协同。8.2.2.3 协同指数和协同系数协同指数（cooperative index ，CI）是指酶的底物结合位点被底物饱和 90%和饱和 10%5（即 V = 0.9Vm 和 V = 0.1Vm）时的底物浓度之比，故协同指数又称饱和比值（Ratio saturation，Rs） 。对于一个可结合 n 个底物分子的酶，其反应式可用下式表示：按米氏方程的推导过程可得 ，式中 。这里假设nSmKVnSEKn 个底物是同时结合上去的。当 V = 0.9Vm 时， S0.9 = ；当 V = 0.1Vm 时，S 0.1 = 。nS1)9( nS1)9(CI = Rs =

9、 =1.09n8因此，当 n1 时，CI81，和以前讲过的单底物单产物反应的米氏方程相同，无协同效应。当 n 1 时， CI 81，为负协同，表示 V 对S 改变的灵敏度减小，且 n 越小负协同效应越大。n 值即为协同系数。从理论上推导上式时，n 是与酶结合的底物分子数，但实际上测出的 n 值（测定方法见后）有小于 1 的情况。上面说的 n 1、 n1、 n 时） 。SKpkHill 模式忽略了 ES，ES 2，ES n-1 等形式的存在，由于协同效应和前述忽略不饱和结合形式的影响，根据 Hill 作图计算出来的 n 值往往小于酶对底物的结合位点数，Hb（hemoglobin ，血红蛋白）上有

10、 4 个 O2 结合位点，但计算8的结果是 n2.62.8。在负协同效应中，每分子酶也结合 n 个底物，但计算的结果却是 n S0.9 或 S K2 K3 K4 是正协同性，K 1 时 ，即 ，余相似， 14K231K21423K12832K， ，在这些条件下就会导致正协同性。同理可得出负协同性的关系式。39488.3.3 MWC 模式1965 年，Monod，Wyman 和 Changeux 最早提出了一个根据酶的构象变化来说明协同效应的分子模式，MWC 模式即以他们 3 人的姓缩写命名。根据此模式的特点，又称为齐变模式（concerted model） 。此模式规定了以下几点：a别构酶是寡

11、聚酶，由同种亚基组成，这些亚基称为原体（protomer） ，它们在寡聚体中占有均等的地位。b一个原体对一种配体只有一个结合位点。c原体有两种构象状态，分别为 R 型（relaxed，松弛态）和 T 型（tensed，紧张态） ，这两种状态在与底物的亲和力、对别构效应剂的反应、催化活力方面可以不同，同一种状态在这些方面是相同的。d在一个寡聚体中，所有的原体均处于同一种构象。各原体构象的转变是同步的，在一个寡聚体中，不存在 R 型和 T 型的杂合体。eR 型和 T 型之间有一个转换平衡。8.3.3.1 底物同种协同效应（以 4 聚体为例）推导略 ，式中 n 等于一个寡聚体中的原体数，nnTRS

12、KSLSKY11 11在上例中 n4。设 ， ，则 。RKSCTRST11nnCLYS )1()(11对上式的讨论：a 当 L 无穷小时，体系中只有 R 型， 。SKYRSb 当 L 无穷大时，体系中只有 T 型， 。TSc 当 时， （两种内在解离常数相等） ， 。TRK1CSKYRSTd 因为 R 型对底物的亲和力恒大于 T 型，所以 值不可能大于 1，C 可在 01 之间取值。TR当 C = 1 时无协同效应；当 C = 0 时正协同效应最大。C 越小正协同效应越大。e L 越大正协同效应越大。表 某些别构酶（别构蛋白）的别构常数别构蛋白 配体 结合位点数 Hill 系数 L C血红蛋白

13、 O2 4 2.8 3105 0.01酵母丙酮酸激酶 磷酸烯醇式丙酮酸 4 2.8 9103 0.01酵母 3-P-甘油醛脱氢酶 NAD+ 4 2.3 60 0.048.3.3.2 异种协同效应MWC 模式也可以解释异种协同作用。12假设底物优先与 R 型结合，别构激活剂 A 也优先与 R 型结合，则 A 的存在可使 R 和 T 之间的平衡偏向 R 型，即 L 值降低，提供更多的 R 型供底物结合用，使 Ys 上升，表现出激活效应，同时底物正协同效应减弱。如果 A 与 R 型的结合不改变 R 型的催化效应，也不改变 KR，则 A 为 K 型激活剂。相反，K 型抑制剂 I 优先与 T 型结合，使

14、 L 值上升，T 型增加， Ys 降低，表现出抑制作用，同时底物正协同效应增强。如果 KR = KT，但 R 型有较高的催化效率，则与 R 型结合的 A 成为 V 型激活剂，与 T 型结合的 I 成为 V 型抑制剂。MWC 模式没有能够解释负协同效应。8.3.4 KNF 模式1966 年，Koshland，Nemethy 和 Filmer 对 Adair 模式进行了扩展，提出了 KNF 模式，根据此模式的特点，又被称为序变模式（sequential model） 。其要点如下：a 在底物或效应剂不存在时，酶的各个原体以同一种构象存在。b 当底物与一个原体结合后，可引起此原体构象的变化，同时使邻

15、近的原体改变对底物的亲和力；第二分子底物与第二个原体结合后，使第二个原体构象发生改变，同时又影响了剩余原体对底物的亲和力。K1K2K3K4（内在解离常数）为正协同效应；K 1K2K3K4 为负协同效应。8.4 引起非双曲线动力学的其他现象8.4.1 酶的记忆现象有些单体酶能表现出 S 形曲线，但又不是因为别构效应引起的。1967 年 Rabin 提出酶 底物复合物能进行异构作用的机制来解释 S 形曲线。在上式中，ES 必须先缓慢地异构成 FS，然后快速地分解（break down）成 F 和 P，F 能够13回复到 E，也可以与 S 结合形成 FS。在低浓度 S 时，酶主要以 E 和 ES 形

16、式存在，产物形成速度被缓慢的 异构化作用所限制。由于S低，F 有较多的比例回复到了 E，只有少量的 F 直接与 S 结合成 FS。当 S高时，又较多的 F 直接与 S 结合成 FS，由于直接生成 FS，避免了 这个限速步骤，所以大幅度地加快了反应速度，从而表现出 S 形曲线。别构激活剂与 E 结合后可以提高异构化速率，别构抑制剂则降低异构化速率。别构效应剂通过影响 k4及 k1 也会影响 S 形曲线的性状。FS 释放出 P 后仍保持 F 构象可以认为是一种 “记忆”现象。有记忆现象的酶称为记忆酶。记忆酶有单底物单产物的，也有双底物双产物的。动物肝脏中的葡萄糖激酶和大麦胚中的己糖激酶都是典型的记

17、忆酶。8.4.2 可引起正协同作用动力学曲线假象的因素a 酶不稳定，但高浓度底物能稳定酶。b 底物和激活剂形成复合物，如 ATP-Mg2+，当 ATP 与 Mg2+ 以 1:1 混合后以不同的量加到反应体系中，则加的量增加 1 倍，ATP-Mg 2+ 增加不止一倍。c 酶含有可与底物可逆结合的杂质，与杂质结合的底物不能作酶的底物。d 随机机制的双底物反应：如果 EEA EAB 途径快于 EEBEAB 途径，则当 A 或 B 有一种饱和时，V 对另一种底物浓度的关系约为双曲线。但如果是 B 低于饱和浓度（ A 不行） ，则 V 对A的关系为 S 形曲线，因为在A 很低时，E 主要与高浓度的 B

18、结合，使反应主要走 EEBEAB 这条慢途径，整个反应速度较慢；随着A的增加，快途占的比例越来越大，使反应速度迅速增加，从而表现出 S 形曲线。e 酶对底物有极高的亲和力：如果酶与底物结合非常紧密，为了测定动力学参数，往往要使用较低的底物浓度，即S不特大于E 。在这种条件下， ， 不能约等于 ，)()(0ESKSESS14其双倒数方程为：141)(1)(120200 SESKESKEkVmm 双倒数作图会表现出假的正协同现象。如果酶反应速度很慢，需要使用较高浓度的酶时，也会造成这种现象。8.4.3 可引起负协同作用动力学曲线假象的因素a非酶催化反应的干扰：如果在酶催化反应的同时，还有一种非酶催化反应存在，其速率也与S成正相关，则在S大到一定程度，酶反应速度已达到 Vm，而非酶催化反应仍可随着S 增加而反应速度增加。当S趋向于无穷大时，V 也趋向于无穷大。因此双倒数作图是一条向下弯曲的通过原点的曲线，呈现出假的负协同曲线。b两个酶催化同一反应：如果体系中有两个 Km 值不同的酶催化同一反应（两个同工酶或一部分酶被修饰后未完全失活，但改变了其 Km） ，则观察到的 V 可由这两个酶反应的速度之和来表示。 21SSm其双倒数方程为： )(1)( 1(12212mmmVSKV当 合适时，可得出负协同曲线的假象。21,mK当 ， ， 时，可得右图。V3104210m