1、1HPLC-ELSD 法分析注射用硫普罗宁含量及有关物质陈来景，郭庭莉，刘鸿敏，张冬云（河南省新谊药业股份有限公司，河南 新乡 453731）摘要 目的：建立注射用硫普罗宁含量及有关物质高效液相色谱蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）检测方法。方法：采用 Kromasil C18（250mm 4.6mm，5m ）色谱柱；柱温 30；甲醇0.5%醋酸溶液 （20：80）为流动相；流速 0.8 mlmin-1；蒸发光散射检测器漂移管温度 44，载气 2.4Bar，撞击器开。结果：进样量在 5.24g25.55g 范围内与峰面积的对数呈良好线性关系（r=0.9994） ，重复性试验 RSD 为 1
2、.08%，检测限和定量限分别为 0.2g 和 0.5g。结论：方法快速、简便，结果准确可靠，重复性好。关键词 注射用硫普罗宁；含量；有关物质；高效液相色谱法；蒸发光散射检测器中图分类号：R917 文献标识码：AHPLC-ELSD Analysis of Tiopronin for Injection and Its Related SubstancesChen Lai-jing，GUO Ting-li，Liu Hong-min，Zhang Dong-yun(Henan Xin-Yi Pharmaceutical Co., Ltd.,Xinxiang Henan 453731)Abstract
3、Objective: To develop an HPLC-ELSD method for the determination of Tiopronin for Injection and its related substances method . Methods: The column:Kromasil C18 (250mm 4.6mm, 5 m).The column temperature: 30 .The mobile phase: methanol -0.5% acetic acid (20:80).Flow rate: 0.8 mlmin-1. The Drift tube t
4、emperature: 44 . Gas Operation Pressure: 2.4 Bar.Impactor on . Results:The calibration curve was linear in the rang of 5.24g 25.55g(r=0.9994). The repeatability(RSD) was 1.08%. The limit of detection and quantification were 0.2 g and 0.5 g respectively. Conclusion: The method is simple and rapid,the
5、 results are accurate and reproducible.Key words Tiopronin for Injection; Content Determination; related substances; HPLC; ELSD硫普罗宁（Tiopronin ） ，化学名 N-(2-巯基丙酰基)- 甘氨酸，首先在日本上市，而后德、意、美、瑞士等国家相继作为改善肝功能药物应用于临床。自注射用硫普罗宁由新谊药业股份有限公司在国内首家上市后，目前已有近十年的生产及临床应用历史。注射用硫普罗宁现行标准 1中没有建立注射用硫普罗宁有关物质检验项目，笔者经过研究，建立了注射用硫普罗
6、宁含量及有关物质 HPLC-ELSD 测定方法，该方法能有效避免硫普罗宁现行标准中 TLC 法及文献中 HPLC-UV 法进行硫普罗宁质量控制的缺陷，且快速、简便，结果准确、可靠，重复性好，现报告如下：一、材料与试剂Agilent 1100 型液相色谱仪；Alltech ELSD2000+蒸发光散射检测器；浙江大学 N2010 色谱工作站；Kromasil C18（250mm 4.6mm，5m）色谱柱。注射用硫普罗宁（河南省新谊药业股份有限公司） ；硫普罗宁对照品（河南省联谊制药有限公司） ；右旋糖酐 40（许昌双马万通制药有限公司） ；甲醇、冰醋酸为色谱纯。二、实验方法1 色谱条件色谱柱：K
7、romasil C18（250mm 4.6mm，5m ） ；流动相：甲醇：0.5% 醋酸溶液 （20：80） ；流速：0.8 mlmin-1；柱温：30；进样量： 10l；蒸发光散射检测器漂移管温度 44，载气 2.4Bar，撞击器开。2 样品溶液制备方法取注射用硫普罗宁分别加入双氧水、浓氨水、冰醋酸、及纯化水，进行相应的氧化、碱水解、酸水解、80升温破坏试验，之后以流动相将破坏后样品溶解，制备成相应的破坏试验考察溶液；另取硫普罗宁、右旋糖酐 40，分别以流动相溶解，制备成原辅料对照溶液。2三、实验结果：3.1 专属性 所采用方法能对样品中各成份进行有效分离，结果详见图 1图 7。3.2 线性
8、范围 精密称取硫普罗宁适量，以流动相溶解定容，制成浓度分别为 0.524gL-1、0.822 gL-1、1.079 gL-1、1.286 gL-1、1.561 gL-1、2.016 gL-1、2.555 gL-1 的硫普罗宁溶液，在上述色谱条件下进行测定，记录色谱图，以进样量（M）与样品出峰面积（A）的自然对数进行线性回归计算 ,回归方程 lnA=1.4381lnM +9.8287，相关系数r=0.9994， （n=7） 。在 5.24g25.55g 范围内，线性关系良好。3.3 精密度 制备 0.1mg/ml、1.0 mg/ml、10.0 mg/ml 的样品溶液，在上述色谱条件下以10l 各
9、重复进样 6 次，测定峰面积， RSD 分别为 1.45%、0.46%、0.19%。3.4 重复性 按含量测定方法，取样品分别制备 6 份样品溶液，测定峰面积并计算含量，RSD 为 1.08%。3.5 回收率 分别精密称取 8mg、10mg、12mg 硫普罗宁对照品加入处方量右旋糖酐 40，每个浓度制备 3 份，按含量测定方法进行试验，回收率符合要求，结果见表 1。3.6 溶液稳定性 取同一对照品溶液在室温下放置，分别在 0，1，5，8，9，10h 取样测定，RSD 为 1.8%,结果表明， 10h 溶液稳定。3.7 检测限、定量限 取对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，检测限为0
10、.2g，定量限为 0.5g。3.8 含量测定 取硫普罗宁对照品适量，精密称定，分别用流动相溶解并定量制成每 1ml 中含硫普罗宁 0.8mg、1.0mg、1.2mg 的溶液，摇匀，作为标准品溶液（1） 、 （2） 、 （3） 。精密量取上述三种溶液各 10l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以标准品溶液进样量的对数值与相应的峰面积对数值计算回归方程，相关系数（r）应不小于 0.99；另取注射用硫普罗宁适量，用流动相溶解并定量稀释制成每 1ml 中约含硫普罗宁 1mg 的溶液，摇匀，作为供试品溶液，同法测定，用回归方程计算硫普罗宁含量，080101-1、080102-1 、080103-1 三批
11、样品含量测定结果分别为 100.6、101.5% 、102.1% ，RSD（n=2）分别为0.88%、1.35%、0.53% 。3.9 有关物质测定 取注射用硫普罗宁一支，加流动相溶解并稀释至 10ml（含硫普罗宁约为10mg/ml）,作为供试品溶液；精密量取供试品溶液 1ml，置 100ml 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；称取右旋糖酐 40 适量，以流动相溶解制成 5mg/ml 的空白辅料对照溶液。照含量测定项下色谱条件，精密量取上述供试品溶液、对照品溶液及空白辅料对照溶液各 10l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的 2.5 倍。扣除空白辅料峰，供试品溶
12、液中如有杂质峰，所有杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%） 。080101-1、080102-1、080103-1 三批样品杂质峰面积之和分别为2175、5563、3345，对照溶液主峰面积分别为 13594、13491、14009，均符合规定。四、 讨论4.1 注射用硫普罗宁国家药品标准 1中,含量测定采用的是碘量法,对注射用硫普罗宁药液进行高温加速破坏，以碘量法测定含量，测定结果出现了小幅度上升，而用本文建立的 HPLC-ELSD 分析方法进行测定，则显示样品溶液中硫普罗宁含量呈下降趋势，且破坏产物量逐渐增加，因而认为现行国家标准中含量方法专属性不强。4.2 高效液相检测器的选
13、择：目前对于硫普罗宁原料、制剂含量及有关物质研究，多采用HPLC-UV 法 23，由于硫普罗宁为紫外末端吸收，方法中流动相的 pH 值较低、水的比例较高，色谱条件较为苛刻，且紫外检测器对于无紫外吸收的杂质不能检出，结构不同的物质在紫外条件下的响应值不同，分析中的受限因素较多。在无有关物质对照品情况下，采用主成份自身对照法进行有关物质检查，检验结果的准确性亦受到一定的影响。本文采用的蒸发光散射检测器是一种通用型检测器，其响应值几乎仅与待测物的质量有关 4，它不依赖于样品的光学特性，可以检测任何挥发性低于流动相的化合物，对于注射用硫普罗宁而言，不仅可以进行主成份的质量控制，对辅料亦有较好的检出性能
14、，且本文所建立的 HPLC-ELSD 分析方法，方法简便，易于操作，使用不同品牌色谱柱进行试验，检验结果的重现性良好，因而认为此种方法更适用于硫普罗宁含量及有关物质分析。4.3 蒸发光散射检测器条件的选择：曾采用蒸发光散射检测器撞击器关的模式进行方法研究，3该模式下，需要的漂移管温度较高，且样品的检出范围窄，不适合用于注射用硫普罗宁含量及有关的测定。4.4 样品溶液配制用溶剂的选择：分别尝试将样品用甲醇、流动相、水溶解后进行测定，试验结果表明，溶剂不同，同一浓度条件下，样品的响应值、出峰状况均不相同，经过综合评定，以流动相作为样品配制用溶剂的方法为最好。五、结论：综上所述，笔者认为本文所建立的
15、 HPLC-ELSD 法分析注射用硫普罗宁含量及有关物质，方法可行，可以用于注射用硫普罗宁的质量监控。参考文献：1 WS1-(X-001)-2005Z,Tiopronin for Injection(注射用硫普罗宁)S.2ZHOU Z M,HE L Y.Determination of the dissolution of Tiopronin tablet by HPLCJ.Practical Pharmacy And Clinical Remedies (实用药物与临床),2007,Vol.10,No.3:190-191.3WANG L P,LIU H L,WU Q.Determinatio
16、n of Tiopronin Injection by HPLCJ.Drug Standards of China (中国药品标准),2008,vol.9,No.1:71-73.4Ch.P(2005) Vol (中国药典 2005 年版.二部)S.2005:Appendix V D表 1 回收率试验结果Tab.1 The results of Recovery True vale/mg Measured vale/mg Recovery/% The average recovery/% RSD/%7.96 8.13 102.148.12 8.31 102.348.14 8.33 102.331
17、0.19 10.38 101.8610.35 10.48 101.26 101.63 0.8910.15 10.44 102.8611.96 11.97 100.0812.42 12.54 100.9712.67 12.77 100.79min 76543210mV1051095908580757065605504540353025201510产产 6.475 A=67934图 1 硫普罗宁 Fig. 1 Tiopronin min 121109876543210mV4644240383634323028262422018161412产产40 2.024 A=26871产产2.598 A=57
18、24图 2 右旋糖酐 40Fig. 2 Dextran 404min 20191817161514131211109876543210mV1401351301251201151101051009590858075706560555045403530252015产产40 1.968 A=614145产产6.418 A=29533图 3 注射用硫普罗宁Fig.3 Injection tioproninmin 17161514131211109876543210mV7570656055504540353025201510产产40 2.025 A=51361产产2.603 A=2962产产产1 3.4
19、3 A=590产产产2 5.367 A=9281产产 6.460 A=8596产产产3 12.78 A=28107产产产4 13.287 A=260392图 4 双氧水破坏Fig. 4 Hydrogen peroxide damagemin 14131211109876543210mV150140130120110100908070605040302010产产402.01 A=49206产产产1 2.750 A=14670产产产2 .978 A=7605 产产 6.39 A=1238图 5 氨水解Fig. 5 The ammonia water hydrolysismin 1716151413
20、1211109876543210mV210200190180170160150140130120110100908070605040302010产产402.01 A=5461产产2 .631 A=3905产产 6.398 A=145385图 6 冰醋酸水解Fig. 6 The acetic acid glacial hydrolysis min 1514131211109876543210mV190180170160150140130120110100908070605040302010产产402.02 A=5205产产2 .608 A=303产产产1 2.857 A=9841产产产2 3.014 A=345产产产1 3.19 A=46759 产产 6.416 A=1329产产产3 12.945 A=359图 7 80 ,4 小时Fig. 7 80 , 4hrs
