1、中国组织工程研究 第 17 卷 第 51 期 20131217 出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 17, 2013 Vol.17, No.51doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.51.015 http:/www.crter.org马骁，石红，黄一飞，黄靖香，崔福斋 . 羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性 J.中国组织工程研究， 2013， 17(51):8875-8880.ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 8875www.
2、CRTER.org马骁，女，1978 年生，内蒙古自治区通辽市人，汉族，2007 年解放军总医院毕业，博士，主治医师，主要从事角膜及眼表疾病的基础和临床工作。通讯作者：黄一飞，解放 军总医院眼科，北京市 100853 mxia-中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2013)51-08875-06修回日期：2013-09-01(201304061/GWW)Ma Xiao, M.D., Attending physician, Department of Ophthalmology, Hospital of Shijitan, Beijing 100038, China
3、Corresponding author: Huang Yi-fei, Department of Ophthalmology, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China mxia- Accepted: 2013-09-01羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性 *马 骁 1，石 红 1，黄一飞 2，黄靖香 2，崔福斋 3 (1北京世纪坛医院眼科，北京市 100038；2解放军总医院眼科，北京市 100853；3清华大学材料科学工程系，北京市 100084)文章亮点：实验的创新在于将羟基磷灰石表面修饰后的人工角膜钛支架植入碱烧伤兔角膜内
4、，通过体内实验证实羟基磷灰石表面修饰法促进了支架材料与宿主角膜的生物整合，提高了钛支架的生物相容性。关键词：生物材料；材料生物相容性；人工角膜；羟基磷灰石；钛；表面修饰；碱烧伤；生物相容性；其他基金主题词：生物相容性材料；羟基磷灰石类；钛；角膜；支架基金资助：解放军十五课题(01MA109) *；解放军十一五课题(06MA281) *摘要背景：纯钛作为安全的生物种植体材料已被用于制作俄罗斯钛人工角膜，但其临床使用中仍存在人工角膜移位、漏水、角膜组织融解或人工角膜排出等并发症。目的：观察经羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架在碱烧伤兔角膜内的生物相容性。方法：将 30 只右眼角膜碱烧伤新西兰白兔随机
5、分为 3 组，实验组于角膜基质层内植入经羟基磷灰石表面修饰的人工角膜钛支架，对照组于角膜基质层内植入人工角膜钛支架，空白对照组仅作角膜板层切口。结果与结论：所有支架在观察期内稳定存留，无角膜坏死融解及支架脱出发生。术后 2，8 周，实验组与对照组炎症细胞浸润数量明显高于空白对照组(P 0.05)，见图 4。图 1 兔角膜碱烧伤后 3 个月(苏木精-伊红染色，200)Figure 1 Corneal tissue 3 mon after alkali burn (Hematoxylin-eosin staining, 200)注：再生的角膜上皮厚薄不均，角膜基质排列不规则，基质内可见新生血管，有
6、多形核白细胞和巨噬细胞浸润，亦有一定数量的纤维母细胞及成纤维细胞存在。图 2 羟基磷灰石表涂层人工角膜钛支架或人工角膜钛支架植入碱烧伤兔角膜Figure 2 Hydroxyapatite modified titanium skirt or titanium skirt for keratoprosthesis was implanted into the corneal stroma of alkali burn rabbits注：支架稳定存留，无角膜溃疡、坏死融解及支架脱出发生。图 3 将不同材料植入碱烧伤兔角膜后 2 周的苏木精-伊红染色(200)Figure 3 Hematoxylin
7、-eosin staining of corneal tissues at 2 wk after different skirt implantation in alkali burn rabbits (200)A：植入羟基磷灰石涂层人工角膜钛支架的实验组注：各组均可见角膜组织界面处大量炎症细胞浸润，主要为嗜酸性粒细胞和巨噬细胞，实验组与对照组炎症反应较空白对照组重。B：植入人工角膜钛支架的对照组C：未植入任何物质的空白对照组图 4 将不同材料植入碱烧伤兔角膜 2，8，16 周后的炎症细胞计数Figure 4 Counting of inflammatory cells at 2, 8, 16
8、 wk after different skirt implantation into the cornea of alkali burn rabbits注：术后 2，8 周，植入羟基磷灰石涂层钛支架组与植入纯钛支架组炎症反应程度相近，均明显高于未植入任何物质空白对照组(P 0.05)，说明羟基磷灰石涂层人工角膜钛支架和人工角膜钛支架一样，均为安全的种植体。术后 2 周 术后 8 周 术后 16 周24201612840羟基磷灰石涂层羟基磷灰石涂层钛组纯钛组空白对照组炎症细胞计数马骁，等 . 羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性P.O. Box 1200, Shenyang 11000
9、4 www.CRTER.org8878www.CRTER.org术后2周组织界面处即可见角膜成纤维细胞增殖，术后2 ，8，16周角膜成纤维细胞计数结果显示，实验组角膜成纤维细胞增殖最显著，明显高于对照组和空白对照组( P 0.05)，见图5。人工角膜支架：扫描电镜见纯钛支架表面平整光滑，见图6 ；经酸碱法预处理后钛表面产生的羟基磷灰石涂层由两层结构组成，外层为疏松的片状羟基磷灰石结晶，内层为羟基磷灰石密集层, 估计羟基磷灰石涂层厚度约为30 m，见图7 。角膜层间取出的人工角膜支架：术后6周，钛支架表面可见细胞及细胞外基质附着，但数量少并呈简单贴附生长；术后12周，钛支架表面细胞数目减少，支架
10、表面仍大部分呈裸露状态，局部区域可见少量角膜组织包裹钛支架，钛/角膜界面未真正愈合，见图8，9。术后6周，羟基磷灰石涂层钛支架表面可见角膜成纤维细胞跨越羟基磷灰石微孔表面向孔内生长，角膜组织呈爬行生长并连接成片；12周后羟基磷灰石涂层钛支架表面大部分被密集的角膜细胞外基质及细胞紧密抓附覆盖，羟基磷灰石涂层钛/角膜界面粘连紧密，愈合良好，见图10，11。图 5 将不同材料植入碱烧伤兔角膜 2，8，16 周后的角膜成纤维细胞计数Figure 5 Counting of corneal fibroblasts at 2, 8, 16 wk after different skirt implanta
11、tion into the cornea of alkali burn rabbits注：植入羟基磷灰石涂层人工角膜钛支架组角膜成纤维细胞增殖最显著，明显高于植入人工角膜钛支架组和未植入任何物质的空白对照组(P 0.05)。术后 2 周 术后 8 周 术后 16 周35302520151050图 6 扫描电子显微镜下钛表面情况(2 000)Figure 6 Surface texture of titanium skirt detected by scanning electron microscope (2 000)注：纯钛支架表面平整光滑。羟基磷灰石涂层钛组纯钛组空白对照组成纤维细胞计数图
12、 7 扫描电子显微镜下羟基磷灰石涂层钛表面及其断层情况(2 000)Figure 7 Surface and tomographic texture of hydroxyapatite modified titanium skirt detected by scanning electron microscope (2 000)注：经酸碱法预处理后钛表面产生的羟基磷灰石涂层由两层结构组成，外层为疏松的片状羟基磷灰石结晶，内层为羟基磷灰石密集层, 估计羟基磷灰石涂层厚度约为 30 m。A：钛表面羟基磷灰石涂层 B：钛表面羟基磷灰石断层扫描图 8 将钛支架植入碱烧伤兔角膜 6 周，角膜组织在支架表
13、面的沉积情况(710) Figure 8 Corneal matrix deposited on the surface of titanium skirt at 6 wk after implantation (710)注：植入后 6 周，钛支架表面可见细胞及细胞外基质附着，但数量少并呈简单贴附生长。注：植入后 12 周，钛支架表面细胞数目减少，支架表面仍大部分呈裸露状态，局部区域可见少量角膜组织包裹钛支架，钛/角膜界面未真正愈合。马骁，等 . 羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 8879www.CR
14、TER.org3 讨论 Discussion对于严重的角膜疾病如Stevens-Johnson 综合征、眼瘢痕性类天疱疮、严重的眼化学烧伤等导致的双眼盲患者，人工角膜是其最终复明的希望，但以往临床中使用的人工角膜材料，如合金、PMMA、PHEMA 、PTFE 等，生物活性差，与宿主角膜的结合多是简单的黏附，因而人工角膜难以在眼内长期稳定的存留 7。调节材料的生物活性使其能与角膜牢固结合融为一体已成为人工角膜进一步发展的方向 8。目前最成功的人工角膜是以患者牙齿作为支架材料的OOKP人工角膜，但 OOKP手术周期长，需损耗患者牙齿，而且长期使用中存在着骨质支架吸收问题 9。实验将骨质中的主要活性
15、成分羟基磷灰石通过酸碱两步法沉积在钛支架表面改变其生物活性，并已在体外实验中证实钛支架经羟基磷灰石表面修饰后，其促角膜成纤维细胞黏附、增殖生长及分化的能力均有提高10。在此研究基础上，作者进一步进行了体内实验，将羟基磷灰石-钛和钛支架分别植入碱烧伤新西兰白兔角膜层间，结果发现羟基磷灰石-钛与角膜组织的界面愈合情况明显优于纯钛支架。羟基磷灰石表面修饰法促进了支架材料与宿主角膜的生物整合。对宿主而言，生物材料植入体内后引发的最普遍反应就是炎症反应，包括早期宿主对手术损伤的修复反应及晚期植入材料诱导的宿主异物反应 11。生物材料的理化特性及表面特性将直接影响炎症反应的进程，而炎症反应的程度和持续时间
16、又将反过来影响到生物材料的稳定性 12-13。实验发现术后2 周和8周时，羟基磷灰石- 钛或钛支架界面炎症反应较轻、程度相近，并随时间炎症反应逐渐减弱，说明羟基磷灰石-钛和钛一样，均为安全的种植体，其引发的炎症反应可被宿主接受，不引起排斥，这与Linnola 等 14的研究结果一致。作者研究发现，虽然两种支架植入角膜后均能促进角膜成纤维细胞的增生及细胞外基质的沉积，但各个观察时间点，羟基磷灰石-钛组角膜成纤维细胞的数目均多于钛支架组，而且两组细胞外基质沉积的形式不同，在钛支架组宿主角膜的胶原纤维平行环绕于钛支架表面，扫描电镜证实这些环绕的角膜组织与钛表面的结合仅是简单的贴附。与钛作为口腔种植体
17、时，牙龈纤维与钛的结合情况相似。这种简单的附着在眼睑和眼球运动等外力作用下将可能发生分离，因此MICOF人工角膜临床使用中存在移位、漏水等并发症。与钛/ 角膜界面不同，在羟基磷灰石-钛支架组，角膜成纤维细胞跨越羟基磷灰石微孔表面向孔内生长，羟基磷灰石- 钛支架表面大部分被密集的角膜细胞外基质及细胞紧密抓附，羟基磷灰石-钛/角膜组织界面愈合良好，Slettebery等 15发现将生物陶瓷从体内排出的难度是钛排出的10倍，其原因即是生物陶瓷与体液接触后在其表面形成了一薄层羟基磷灰石，从而限制了其排出。羟基磷灰石是目前公认的较好的生物相容性材料，其可促进软/硬组织间的生物整合，但纯羟基磷灰石脆性大、
18、质硬、可塑性差 16，单独作为人工角膜支架时图 9 将钛支架植入碱烧伤兔角膜 12 周，角膜组织在支架表面的沉积情况(200)Figure 9 Corneal matrix deposited on the surface of titanium skirt at 12 wk after implantation (200)图 10 将羟基磷灰石涂层钛支架植入碱烧伤兔角膜 6 周，角膜组织在支架表面的沉积情况(1 900)Figure 10 Corneal matrix deposited on the surface of hydroxyapatite modified titanium s
19、kirt at 6 wk after implantation (1 900)注：植入后 6 周，羟基磷灰石修饰的钛支架表面可见角膜成纤维细胞跨越羟基磷灰石微孔表面向孔内生长，角膜组织呈爬行生长并连接成片。图 11 将羟基磷灰石涂层钛支架植入碱烧伤兔角膜 12 周，角膜组织在支架表面的沉积情况(200)Figure 11 Corneal matrix deposited on the surface of hydroxyapatite modified titanium skirt at 12 wk after implantation (200)注：植入后 12 周，羟基磷灰石修饰的钛支架表
20、面大部分被密集的角膜细胞外基质及细胞紧密抓附覆盖，羟基磷灰石涂层钛/角膜界面粘连紧密，愈合良好。马骁，等 . 羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org8880www.CRTER.org无法承受眨眼时眼睑对角膜的加压，易发生碎裂。将羟基磷灰石涂覆到钛支架表面制成复合材料，可使其兼有羟基磷灰石的生物活性和金属较强的力学性能，为临床改良MICOF 人工角膜提供了新方法。临床中人工角膜的适应证是严重血管化及长期存在慢性炎症的病变角膜，在这些角膜中角膜成纤维细胞增生及胶原沉积能力均不足 17。实验中建立中度兔角膜
21、碱烧伤模型，烧伤后不给予任何抗炎及抗胶原酶药物治疗，以使损伤更大化，并选择于碱烧伤3个月后植入羟基磷灰石/钛和钛支架，因为此时兔角膜仍处于炎症反应期，角膜成纤维细胞少，组织愈合功能差，可较好地模拟临床实际情况，使实验更具意义。作者贡献 ：黄一飞、马骁进行实验设计 ，实验实施为马骁，实验评估为石红， 资料收集为马骁 ，马骁成文，黄一飞审校，马骁对文章负责。利益冲突 ：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。伦理要求 ：实验过程中对动物的处置符合 2009 年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。学
22、术术语 ：表面改性-指在保持材料或制品原性能的前提下，赋 予其表面新的性能，如 亲水性、生物相容性、抗静 电性能、染色性能等。表面改性的方法有很多报道，大体上可以 归结为:表面化学反应法、表面接枝法、表面复合化法等。作者声明 ：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文 责自负。4 参考文献 References1 黄一飞,王丽强,王凤翔.人工角膜植入术的临床研究J.中华眼科杂志,2003, 39(10):9-12. 2 Huang YF,Yu JF,Liu L,et al.Moscow Eye Mic
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