1、,现代色谱-质谱联用技术及其在中药分析中的应用1,Hyphenated Methods,The combination of a chromatographic and spectral method can exploit advantages of each: Chromatography - produces pure fraction from your sample. Spectral methods - yields qualitative information about a pure component.,Hyphenated Methods,There are differ
2、ent kinds of the methods: Gas chromatographyMass Spectrometry - GC-MSInfrared Spectrometry - GC-FTIR Liquid ChromatographyMass Spectrometry - LC-MSNuclear Magnetic Resonance - LC-NMR,质谱技术,质谱（Mass Spectrometry）：是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。 质谱仪：一类能使物质粒子转化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离
3、，并检测强度后进行物质分析的仪器。 质谱仪：分析系统、电学系统和真空系统,特点,质谱仪,Outlet,质量分析器,提供足够的平均自由程提供无碰撞的离子轨道减少离子-分子反应减少背景干扰延长灯丝寿命消除放电增加灵敏度,为什么MS需要真空,真空系统,离子源 ionization source,EI源：电子轰击型离子源 CI源：化学电离源 FAB源：快原子轰击电离源 ESI源：电喷雾型离子源 MALDI源：基质辅助激光解析离子源 APCI源：大气压化学电离源 ,离子源：质谱仪中使被分析物质电离成离子的部分。,电子轰击型离子源 (Electron impact source, EI),最常用的一种离子
4、源 有机分子被一束电子流（能量一般为70eV）轰击，失去一个外层电子，形成带正电荷的分子离子（M+ ） ， M+ 进一步碎裂成各种碎片离子、中性离子或游离基，在电场作用下，正离子被加速、聚焦、进入质量分析器分析。,REPELLER,电子电离（EI）,优点：灵敏度高，有丰富的碎片离子信息和成熟的离子开裂理论，是结构分析、鉴定的有力手段；重现性好，有标准图谱，可以通过谱库检索对未知物进行结构鉴定。缺点：样品须汽化后才可离子化适用化合物：易挥发、热稳定化合物。,二氧化碳EI源质谱图,基本原理： 将反应气（甲烷、异丁烷、氨气等）与样品按一定比例混合，然后进行电子轰击，甲烷分子先被电离，形成一次、二次离
5、子，这些离子再与样品分子发生反应，形成比样品分子大一个质量数的（M+1） 离子，或称为准分子离子。准分子离子也可能失去一个H ，形成（M-1）离子。,化学电离源 (Chemical ionization source, CI),CI（化学离子化） 软电离技术优点：可以得到较强的准分子离子峰，有利于分子量的测定缺点：样品须汽化后才可离子化适用化合物：易挥发、热稳定化合物,API（大气压离子化） 软电离技术（1）ESI（电喷雾离子化）特点：能够产生多电荷离子。适用化合物：对生物大分子及其他分子量大的化合物的分析较有利。,（2）APCI（大气压化学离子化） 特点：一般只给出化合物的分子量信息，通过源
6、内CID（碰撞诱导分解）可同时获得结构信息。 适用化合物：与ESI比较，更适于分析极性及分子量小（1000 amu）的化合物。,EI Full Scan MS of Reserpine,Many ions; information rich,Electron ionization spectrum from NIST; probe sample introduction,ESI (+) Full Scan MS of Reserpine,ESI generates few ions Limited information,质量分析器 Mass Analyzer,磁偏转质量分析器 四极杆质量分析
7、器 离子阱质量分析器 飞行时间质量分析器 傅立叶变换离子回旋共振质量分析器,将离子源中形成的离子按质荷比的差异进行分离的装置。,四极质量分析器 （quadrupole analyzer）,由四根平行圆柱形电极组成，电极分为两组，分别加上直流电压和一定频率的交流电压。 样品离子沿电极间轴向进入电场后，在极性相反的电极间振荡，只有质荷比在某个范围的离子才能通过四极杆，到达检测器。 其余离子因振幅过大与电极碰撞，放电中和后被抽走。 改变电压或频率，可使不同质荷比的离子依次到达检测器，被分离检测。,四极质量分析器,四极质谱结构简单，价廉，体积小，易操作，扫描速度快，适合于GC-MS, LC-MS。分辨
8、率不高。,Quadrupole Mass Analysers,Relatively cheap and compact Low (unit) resolution R 2,000 Upper mass limit of m/z 4,000 Can be offset by use of ESI (multiple charges) Simple to operate and control Simple interfacing with inlet systems GC, DIP, etc. Workhorses of mass spectrometry,离子阱质量分析器 (Ion Trap,
9、 IT),如果将四极杆质量分析器的两端加上适当的电场将其封上，则四极杆内的离子将受X,Y,Z 三个方向电场力的共同作用，使得离子能够在这三个力的共同作用下比较长时间的呆在稳定区域内，就象一个电场势阱，这样的器件被称为离子阱。,27,五味子酯甲的多级裂解质谱图,MS1,MS2,MS3,-C6H5COOH,-C2H4O,-H2O,28,五味子酯甲的多级裂解质谱图,MS4,MS5,MS6,-CH3,-CH3,飞行时间质量分析器 (Time of Flight, TOF),质荷比与时间的平方成正比，只要测定出飞行时间，就可换算成质荷比。在检测时，显然是质荷比小的先到达检测器，质荷比大的后到达。在通常情
10、况下，离子的飞行时间为微秒数量级。,Agilenttof,M+H 433.2227, M+Na 455.2035, M+K 471.1766 与数据库中理论分子量进行对比，初步定性 利用analyst QS数据分析软件的计算工具进行验证，计算精确分子量和元素组成，绘制理论同位素分布与实测值进行比较,分子离子: M+ , M - e M+ ,z=1时， 其m/z等于天然丰度最大的同位素的原子量之和。,碎片离子：广义上指除分子离子以外的所有离子。,母离子与子离子：任何一个离子进一步裂解为质荷比较小的离子，前者是后者的母离子或前体离子，后者是前者的子离子。,质谱中的离子,多电荷离子：如 z=2的离子
11、，存在于稳定的结构中,准分子离子： M+H+, M-H+,气相色谱-质谱联用技术 (Gas Chromatography/Mass Spectrometry,GC/MS),气-质联用法与气相色谱法的比较,GC-MS方法定性参数增加，定性可靠。能提供保留时间，质谱图，由质谱图、分子离子峰、碎片离子峰强比、同位素离子峰、选择离子的子离子质谱图进行定性; GC样品处理方法、分离条件、仪器维护等多数可移植成为气-质联用的方法； GC-MS法 /通用的检测方法 /灵敏度,GC/MS联用仪系统真空系统气相色谱 接口 离子源 质谱检测器 结果(EI/CI) (四极杆、磁式)计算机,1200 GC/MS &
12、GC/MS/MS,Single Quad System,Click mouse for MS upgrade,Single to Triple Quad Upgrade,Triple Quad System,1200L GC/MS/MS,接 口 interface,接口的功能主要有两点： 降低柱出口压力，以满足质谱仪的要求； 排除大量载气，使感兴趣的色谱馏分经浓缩后适量进入离子源,INTERFACE,GC,MSD,10-5 Torr,2 mL/min,760 Torr,0.5 - 15 mL/min,常见的接口技术主要有三种： * 直接导入型接口Capillary direct interfa
13、ce * 喷射式分子分离器接口Molecular separator * 开口分流型接口Open split interface,* 直接导入型接口,四极杆分析器,待测物,载气,直接导入型接口,直接导入型接口的实际作用是支撑插入毛细管柱，使其准确定位；并保持温度，使色谱柱流出物不产生冷凝。载气限于氦气或氢气，GC流量应在0.71.0ml/min为佳。 优点：技术简单、样品利用率高、死体积小。 例如：HP 5973 GC/MSD、Finnigan TSQ-7000 GC-MS-MS。,* 喷射式分子分离器接口,GC,MS,真空泵,气体在喷射过程中不同质量的分子都以超音速同样速度运动，不同质量的分
14、子具有不同的动量。 动量大的分子易保持喷射方向，动量小的易偏离。 载气偏离接受口，待测组分被浓缩。,* 开口分流型接口,氦气,排空,GC,MS,外套管,内套管,色谱柱后洗脱物定量的部分引入质谱仪的离子源。 外套管内氦气帮助过多流出物排出。 内套管连接色谱柱和限流毛细管。,三种接口技术的主要工作参数 接口 输入流量 传输率 浓缩 适用性（ml/min） （%） 倍数 喷射式 1080 50 50 填充柱/毛细管柱 开口分流 1100 30 1 毛细管柱 直接导入 15 100 1 小孔径毛细管柱,联机分析所提供的信息,色谱保留值 总离子流色谱图（TIC） 质量色谱图（MC） 选择离子监测图（SI
15、M） 质谱图,总离子流色谱图（TIC）,离子流强度,时间或扫描次数,总离子流色谱图的三维显示,质量色谱图,m/z 207,m/z 303,m/z 285,时间,离子流强度,质谱库,用标准电离条件即EI电子轰击电离源，70eV电子束轰击已知纯有机化合物，将这些标准质谱图和有关质谱数据存储在计算机的磁盘中就得到质谱库。 三个通用质谱谱库： 1、NIST库 由美国国家科学技术研究所（National Institute of Science and Technology）出版，最新版本收有64K张标准质谱图。,2、NIST/EPA/NIH库 由美国国家科学技术研究所（NIST）、美国环保局（EPA）
16、和美国国立卫生研究所（NIH）共同出版，最新版本收有129K张标准质谱图，约有107K个化合物及其结构式。 3、Wiley库 有3种模式。第六版本的Wiley库收有标准质谱图230K张；Wiley/NIST库收有标准质谱图275K张；Wiley选择库（Wiley Select Libraries）收有标准质谱图90K张。,苏氨酸,GC/MS在中药研究中的应用,中药资源研究药材的比较鉴定: 对不同产地或引种地、不同部位、不同贮存条件及不同季节、干品与鲜品药材的比较 中药材及中成药有效成份的分析测定、结构的确定 中药质量控制指纹图谱研究 中药生产工艺研究：饮片的炮制、复方浸膏的提取分离、方剂制剂工
17、艺等 与药效研究相结合、药代动力学研究,GC/MS研究辛夷挥发油指纹图谱,辛夷挥发油的提取,化学计量学辅助GCMS用于辛夷挥发油化学成分和抗炎作用机制研究，曲丽萍，第二军医大学博士论文，2010,气质联用条件,化学计量学辅助GCMS用于辛夷挥发油化学成分和抗炎作用机制研究，曲丽萍，第二军医大学博士论文，2010,数据分析,通过数据库检索，有34个成分是12批药材共有的 采用峰归一化法对相对含量进行计算 求算共有峰相对含量平均值，寻找含量最高的成分：桉油精，异合金欢醇，-水芹烯，莰烯，柠檬烯， -杜松醇， -芳樟醇，石竹烯，邻聚伞花素等 N强峰寻找，含量70%,化学计量学辅助GCMS用于辛夷挥发
18、油化学成分和抗炎作用机制研究，曲丽萍，第二军医大学博士论文，2010,指纹图谱评价指标,重叠率：相互比较的样品的各自峰数及两者共有峰的基础上，从质的角度上考虑相关性 共有峰率=（共有峰面积之和/独立峰面积之和）*100% 变异率=（变异峰面积之和/共有峰面积之和） *100%,辛夷挥发油对急性炎症大鼠模型抗炎作用的代谢组学研究,建立角叉菜胶致SD大鼠急性炎症模型，用GC-MS分析正常、模型及给药大鼠的血浆代谢谱，采用NIST数据库对大叔血浆中的内源性代谢物进行定性，使用多元模式识别方法分析大鼠不同组间的代谢物谱差异，找出潜在的生物标记物,化学计量学辅助GCMS用于辛夷挥发油化学成分和抗炎作用机
19、制研究，曲丽萍，第二军医大学博士论文，2010,代谢组学是系统生物学的重要组成部分，是继基因组学，转录组学，蛋白质组学之后出现的以定量描述生物体内代谢物多参数变化为目标的新兴“组学”。 代谢组学关注的是体液中的小分子集合，对于这些小分子必须借助现代微量和痕量分析仪器进行分离分析，由于小分子集合组成的异常复杂性，决定了我们应用分析仪器必将获得大量的数据，对于大量数据的分析和挖掘需要借助化学计量学方法和软件，对于特定的代谢标记物，代谢途径，代谢网络，需要用数据库管理，以及开发出具有特定用途的专家系统等。 借助代谢组学技术研究中医药具有重要的意义。这将从生物体体液中的小分子层次为我们带来新的认识和知识。,化学计量学辅助GCMS用于辛夷挥发油化学成分和抗炎作用机制研究，曲丽萍，第二军医大学博士论文，2010,
