1、,南京医科大学 第一附属医院 核医学教研室 邱宁岩,第五章 体外分析技术,体外分析技术,1.体外放射性分析技术 (in vitro radioassay)放射性竟争结合分析 *放射免疫分析(RIA)(competitive radioactive binding assay) 放射性非竞争结合分析 *免疫放射分析(IRMA)(non-competitive radioactive binding assay) 2.体外非放射性标记免疫分析技术化学发光免疫分析时间分辨荧光免疫分析酶免疫分析,体外免疫分析技术的示意图,固相支持物表面,待测物,包被抗体,标记抗体,竞争法,非竞争法,标记抗原,第一节
2、放射免疫分析的基本原理 (radioimmunoassay, RIA),诺贝尔医学奖获得者 Yalow博士。 1959年 Yalow和 Berson两位博士在研究胰岛素的抗体时发展起来的。最早建立的是INS的RIA法。 RIA法是一种高特异性、 高灵敏度的微量检测技术。,American physicist and medical researcher Rosalyn Yalow, corecipient of the 1977 Nobel Prize in physiology or medicine, “for the development of radioimmunoassays of
3、 peptide hormones.“,一、放射免疫分析的基本原理 放射免疫分析法是利用限量的特异抗体与标记抗原和非标记抗原的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出非标记抗原量的一种超微量分析技术。,American physicist and medical researcher Rosalyn Yalow, corecipient of the 1977 Nobel Prize in physiology or medicine, “for the development of radioimmunoassays of peptide hormones.“,(限量抗体）占总T的 3
4、0-50%,放射免疫分析的基本原理示意图,放射免疫分析（RIA）的特点：,1.*Ag和Ag与Ab有相同的亲和力 2. *Ag和Ab为恒量时，*Ag和Ag的总 量大于Ab上的有效结合位点。 3. Ag的量与*AgAb 的量成反比， 而与游离的*Ag成正比。,建立标准曲线,目的：利用标准曲线来推算出病人样品（Ag）的含量。 配制一系列的标准品浓度：（0、20、40、80、160和320ng/L）0ng/L 20ng/L 40ng/L 80ng/L 160ng/L 320ng/L 通过测定*AgAb或*Ag的量可建立标准曲线。,1B。,2,3,4,5,6,B/T100%,F/T 100%,B/F 1
5、00%,标 准 曲 线 的 纵 坐 标-结 合 率 （B/B+F、F/B+F、B/F、B/B。 100%） 标 准 曲 线 的 横 坐 标-标 准 品 浓 度,二、 放射免疫分析的基本条件 特异性抗体、标记抗原、标准品、 分离技术、放射性测量仪器 1、特异性抗体 高亲和力、高特异性、高滴度的抗体。,（1）高亲和力的抗体： 亲和力（Affinity)是指抗原和抗体之间的一种结合能力。 亲和力的测定方法是： Scatchard作图， 以AgAb的浓度为横坐标，以B/F为纵坐标绘制直线，观察直线的斜率（-KA） 。标准曲线的斜率越大，表明抗体亲和力越高，抗原抗体的结合也越紧。,抗体亲和力的Scatc
6、hard作图,（2）高特异性的抗体： 抗体的特异性(Specificity)指：抗体分别与相应的抗原和抗原结构类似物的结合能力的比较。 一般用交叉反应(Cross Reaction)来表示，交叉反应越小，抗体的特异性越高。反之，抗体的特异性就差。,抗CGMP抗体的交叉反应图,（3）高滴度的抗体： 抗体滴度(Titer)指抗体实际应用时的稀释倍数。 稀释倍数越大，抗体的滴度越高，滴度一般要求在1/1000以上为好。 滴度曲线的目的：确定抗体稀释度；找出抗原和抗体的最适比例（B/T为50%时的抗体稀释度）。 看一看抗体滴度曲线,抗体滴度曲线,2、标记抗原:,1)比放射性活度高而适当；比放射性活度并
7、不是越高越好 比放射性活度：是指每微克抗原上标记放射性核素的千贝可KBq/ug. 被测抗原浓度高-比活性 被测抗原浓度低-比活性 1Bq=1/S 1Ci=3.7 10Bq 2)保持标记抗原的免疫活性： 每个蛋白质分子上标记1-2个碘原子。,3)便于放射性测量： 125I标记的抗原有r射线能直接测量 4)放射化学纯度高： 放射化学纯度: 是指具有免疫活性的标记抗原占总放射性的百分数。 放化纯度要求大于90%以上 5)半衰期适当： 125I半衰期60天、131I半衰期8天、3H半衰期12.5年,3. 标准品,标准品是用来制备标准曲线用的。 标准品抗原的要求： （1）高纯度的抗原 （2）化学结构、免
8、疫活性与待测抗原一致,4. 分离技术,1）双抗体法： *Ag+Ab1= *AgAb 1+ Ab2=*AgAb1Ab2+ *Ag + Ag = AgAb 1+ Ab2=AgAb1Ab2 + Ag 优点：特异性强、非特异本底低。缺点：反应时间长。,2）沉淀法（聚乙二醇法）： 加入30%的PEG，通过吸水作用使蛋白质脱水，致r球蛋白（B）沉淀 优点：能快速分离；缺点：非特异本底高。 3） 吸附分离法（活性炭吸附法）： 吸附（F）的部分（分子量小），离心后使F沉淀，B悬浮在溶液中。测定溶液部分的放射性计数。 优点：能快速分离； 缺点：非特异本底高。,4）双抗体沉淀法（PR试剂法）： 双抗法+PEG法的
9、结合，融合了两种方法优点。 第二抗体和PEG的用量都减少 优点：能快速分离、特异性高、非特异本底低。 是目前最好的方法之一。 5）固相分离法: 试管固相法： 优点：操作简便 缺点：抗体吸附量小。 微球法和微粒法： 优点：操作简便 、 抗体吸附量大。 磁性颗粒法： 优点：操作简便 、快速、 抗体吸附量大,5.放射性测量仪器： 根据不同的放射性核素选择不同的放射性测量仪器。 125I选用-计数器进行测量。 3H选用液体闪烁计数器。,RIA基本操作步骤示意图,1.加待测样品 或标准品,2.标记抗原,4. 37温育，使反应达到平衡,5.加B与F分离剂,6.放射性计数器检测,3.加特异性抗体,单探头手动
10、r-计数器,单探头便携式手动r-计数器,（三）RIA的质量控制 质量控制:就是利用一些客观的指标，经常对分析质量进行检查，遇有质量异常则及时采取对策，以保证分析误差控制在可接受的范围。 质量控制的目的： 保证实验分析误差控制在可接受的范围。 判断试剂盒质量和方法学的稳定性。,1.实验室内部质量控制：,零标准管结合率（ Bo %） 非特异结合率（NSB%） 最低和最高浓度管之差 标准曲线直线回归参数 ED25、ED50、ED75 质控图,1）零标准管结合率（ Bo %）：最大结合率,Bo%指：Ag=0时，*Ag与Ab的最大结合率。 最大结合率不是越高越好，最大结合率过高（80-90%）可能影响R
11、IA的灵敏度。有时为了提高灵敏度把最高结合率调到30-50%，以提高灵敏度。,2）非特异性结合（NSB%）：,当Ab=0时，*Ag与非特异性物质的结合率。 一般应小于5-10%。NSB越低越好。NSB的高低可以反应B与F分离技术的好坏。如：双抗法的NSB低；PEG法的NSB高。,3） ED25、ED50、ED75：,指B/B。 100%（结合率）=25%、50%、75%时，横坐标上所对应的浓度值。主要用来反应标准曲线的稳定性;曲线向右漂移ED值升高。曲线向左漂移ED值降低。见图 试剂盒稳定、实验操作正确则每次的ED值，应在一定范围波动。 如波动异常，表明标准品变质或用量有误。,用ED25、ED
12、50、ED75值判断 曲 线 的 漂 移 情 况,CEA的标准曲线,4）标准曲线直线回归参数,标准曲线的主要质控指标：截距a、斜率b和相关系数r 要求a、b值稳定，r0.99,2.评价RIA试剂盒质量的指标,精密度 准确性 灵敏度 特异性 稳定性 健全性,1） 精密度 (Precision) 是指同一样品重复测定的实测值的离散程度。离散程度越小，表明分析系统的精密度越高。常以变异系数（CV）表示。 CV%(变异系数）=标准差（S）/平均数100% （1）精密度图：用以判断分析系统复管的变异情况(CV)应7% 通常都是两侧的变异系数大，特别是低剂量区。见图,T4的RIA精密度图,纵 坐 标 复
13、管CV%、 (CV 应 7% ),横 坐 标 T4 的 浓度（KIU/L）,2）灵敏度 （Sensitivity) 就是指统计上能与零剂量相区别的最小量。 一般指测定方法的最小可检出量。既B。90%所对应的值。 3）准确度(Accuracy) 是指样品的测定值偏离真值的程度。 （1）回收率：回收率越接近100%说明该方法准确度较好。 回收率=测定值/真实值100%,3.实验室外部质量控制,按照一定的评价方案和方法，对各实验室的实验项目进行分析比较。 提高各实验室之间结果的可信性和可比性。,第二节：免疫放射分析 （Immunoradiometric Assay, IRMA）,IRMA是1968年
14、提出的，它是RIA的一种变种。一. 基本原理 免疫放射分析法是利用过量的标记抗体与非标记抗原形成复合物，用免疫吸附剂除去多余的游离的抗体，发现复合物的放射性与非标记抗原的量呈正相关。 Ag + *Ab = Ag-*Ab + *Ab （过量） （B） （F）,二.基本方法 （一）双抗体夹心法 Ab1(过量）+Ag Ab1Ag +*Ab2Ab1Ag*Ab2+*Ab2 （二）标记第三抗体法 Ab1（过量） +Ag Ab1Ag +Ab2 Ab1AgAb2 + *Ab3 Ab1AgAb2 *Ab3 + *Ab3 （三）双标记抗体法 （四）IRMA-生物素-抗生物素蛋白测定系统,双抗体夹心法IRMA示意图
15、,标记第三抗体法,三、免疫放射分析法的特点： (Immunoradiometric Assay),1.反应动力学：非竞争性抗原抗体结合反应。Ag-*Ab复合物的量与非标记抗原的量呈正相关。 2.灵敏度：灵敏度高出RIA10倍。特别在低剂量区。 3.特异性 4.稳定性 5.标准曲线的工作范围 6.缺点：抗原必须有两个以上的抗原决定簇。,第四节 非放射性标记免疫分析 放射性和非放射性标记免疫分析的异同： 相同点： 基本原理相同（利用AgAb进行的免疫结合反应） 反应类型相同（竞争性或非竞争性的分析方法） 不同点： 标记物不同：一种是放射性的标记物；另一种是酶、化学发光物、镧系元素。 测量的信号不同
16、：一种是放射性的计数;另一种是光信号 测量仪器也不同：一种是r-计数器；另一种是发光仪,一、化学发光免疫分析技术,化学发光免疫分析技术 鲁米诺、异鲁米诺和吖啶脂 化学发光酶免疫分析技术 碱性磷酸酶 电化学发光免疫分析技术 三联吡啶钌（Ru(bpy)3）2+,（一）化学发光免疫分析技术 （chemiluminescence immunoassay) 1.基本原理： 利用能产生化学发光的化合物标记抗原或抗体，建立竞争性或非竞争性的免疫分析法。化学发光物经适当处理后能发生化学反应，同时以光子形式释放出能量。最后通过测定化学发光物发光的强弱来推算出待测抗原的量。,2.常用的化学发光标记物：,鲁米诺、异
17、鲁米诺和吖啶脂等 吖啶脂的特点是： 分子量小； 可以直接标记抗原和抗体； 发光标记物很稳定（有效期可达一年左右）,3.化学发光免疫分析的反应式： Ag + Ab吖啶脂（过量）= Ag-Ab吖啶脂+Ab吖啶脂 然后利用分离技术，分离B与F。 在Ag-Ab吖啶脂中加入H2O2和硷性溶液（PH11以上）。 即可迅速发光，然后进行测量分析。见图,甲基氮蒽-吖啶脂标记抗体的 化学发光免疫分析流程图。,吖啶酯化学发光系统,CH3,C=O,O,R,N+,OH-,H+,H2O2,+ H2O,+,R,OH,光子 + CO2 +,CH3,C=O,O,R,N,HO,CH3,C=O,O,R,N,HOO,CH3,O,N
18、,CH3,O,N,C=O,O,闪光与辉光及其测量方式的差别,时间,发光信号,辉光坪区,速率法测量,原位进样,积分法测量,闪光尖峰,4.化学发光免疫测定的优缺点： 优点： (1)直接标记的化学发光。 (2)对温度和PH的变化相对不敏感。 缺点：（1）发光时间集中在加入H2O2 和硷性溶液后的短时间内。 （2）试剂和仪器的成本较高。,ACS:180 SE,Allergy Testing,Not available in USA,ADVIA Centaur Methods,Thyroid Function TSH TSH-3rd Gen. T4 Free T4 T3 Free T3 T-Uptake
19、 Anti-TPO Anti-TG,Fertility Total hCG LH FSH Prolactin Estradiol-6 Estradiol II-6 Testosterone Progesterone,Oncology AFP CEA PSA cPSA fPSA* CA125II CA19-9 CA 15-3 BR 27.29 HER-2/neu,Cardiac CKMB Troponin I - Ultra Myoglobin Homocysteine BNP,Anemia B12 Folate RBC Folate Ferritin,Allergy Total lgE 225
20、 sIgEs,mixes Screens,Ther. Drug Monitor Digoxin Digitoxin Tobramycin Carbamazepine Phenobarbital Gentamicin Phenytoin Vancomycin Theophylline Valproic acid *Cyclosporine - 2006,Infectious Disease Rubella lgG Rubella lgM Toxoplasma lgG Toxoplasma lgM HBsAg HBsAg Confirmatory Anti-HBs HBc IgM HBc Tota
21、l HCV HIV 1/0/2 HAV IgM HBeAg* HAV Total Anti-HBe*,Adrenal Serum Cortisol Urine CortisolMetabolic Insulin C-Peptide (S/U) Intact PTH,*in development Assay developed, manufactured, and sold by Bayer HealthCare for Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.,Autoimmune *ANA 2006,65 Immunoassays,（二）化学发光酶免疫分析技术 (c
22、hemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA）,1.基本原理： 利用碱性磷酸酶标记抗原或抗体，建立竞争性或非竞争性的免疫分析法，反应完加入底物（金刚烷），最后酶促底物发光，通过测定发光的强弱，来推算出待测抗原的量。,2.化学发光酶免疫分析（CLEIA）的标记物： 碱性磷酸酶（AKP） 3.化学发光酶免疫分析的特点： 以碱性磷酸酶（AKP）为标记物来标记抗原或抗体。 以金刚烷作为发光底物。,4.底物金刚烷的发光机制,5.化学发光酶免疫分析的优缺点： 优点：（1）全自动化检测。 （2）灵敏度高、精确性好。 （3）药盒有效期长。 缺点：（1）仪器和样品的成本较高
23、。 （2）新项目的研制开发较慢。,（三）电化学发光免疫分析技术 （electrochemiluminescence,ECLIA）,电化学发光免疫测定：是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物。ECL和CL 的差别： ECL:是电启动发光，发光分子可反复利用，可控发光 CL:是化合物简单的混合启动的发光，发光分子只能利用一次。瞬间发光,1.电化学发光免疫分析的原理： Ag + Ab1钌 + Ab2生物素=钌Ab1AgAb2生物素 + 亲和素磁粒 = 钌Ab1AgAb2生-亲磁粒 + Ab1钌 + Ab2生物素 钌Ab1AgAb2生-亲-磁粒被吸附到电极表面后，当给电极施加电压时，钌标记的化合
24、物和TPA（三丙胺）发生反应，导致发光。一但撤去电压，钌标记的化合物和TPA仍保持稳定。,2. 电化学发光的发光剂：,标记物是： 三联吡啶钌（Ru(bpy)3）2+ 电子供体是： 三丙胺（TPA）,三联吡啶钌（Ru(bpy)3）2+,测量池,ECL 的测量池,电极,电极,工作电极,磁铁,光电倍增管,TPA,TPA,TPA,TPA,3.电化学发光的特点：, 发光可以精确控制，灵活性强。 生物素-亲和素间接包被，可大大提高方法的灵敏度。 检测范围宽。如：HCG（0-1000IU/ML） 灵敏度高。,样本盘型,样本架型,Elecsys1010,Elecsys2010,E170,Elecsys 101
25、0侧视图,模块式电化学发光仪(Elecsys)170,二、时间分辨荧光免疫分析技术 (time-resolved fluoroimmunoassay,TrFIA),（一）基本原理： 用镧系元素铕(Eu)标记抗体或抗原，建立竞争性或非竞争性的免疫分析法。反应完后，需设法把Eu游离出来再形成一个发射荧光的络合物。最后通过测定荧光发光的强弱来推算出待测抗原的量,夜幕下萤火虫跳动的靓影,1.时间分辨荧光免疫分析的标记物： 镧系元素：铕(Eu),铽(Tb),钐(Sm),镝（Dy) 当镧系元素为离子价态时（如：Eu3+;Tb3+）。 受激发光照射后会发出长半衰期的荧光。 2.时间分辨荧光免疫分析的概念：,
26、3.TRFIA的优缺点： 优点： （1）原子标记，标记物更稳定。 （2）双标记技术和多标记技术的应用。 缺点： （1）试剂和仪器的成本较高。 （2）新项目研制开发较慢。,三、酶标记免疫分析 (enzyme immunoassay) （一）原理 利用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体分子，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。 1.酶免疫分析技术中发展最好的是： ELISA（酶联免疫吸附分析） 2.常用的酶标记物： 碱性磷酸酶（AKP）、*辣根过氧化物酶（Horseradish）和半乳糖苷酶（DG）,3.ELISA夹心法的反应原理： Ab1 + Ag =Ab1Ag + *Ab2 = Ab1Ag*Ab2 + *Ab2 （过量） (过量） 洗涤分离B与F，加入底物 利用分光光度计进行测量。 其颜色的深浅与抗原抗体复合物上酶的量成正比，即与待测抗原成正比。 同时利用标准品也可以建立标准曲线，进行定量测定。,固化在反应板,发色,（二）ELISA的优点和缺点 优点：无放射性、 容易普及（用分光光度计可测量） 缺点： 1.灵敏度差 2.受反应温度、PH、溶血的影响大； 3.发色反应是酶免疫分析的致命弱点。,再 见！,
