1、肺炎基因芯片结果生物信息学分析基因芯片(genechip)（又称 DNA 芯片、生物芯片） ，最早在 80 年代中期提出，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于 2cm x 2cm 的硅片、玻片等支持物，然后与待测的荧光标记样品的基因按碱基互补配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号强度作出比较和检测，进而获取样品分子的数量和序列信息 1-5。基因芯片技术也在 1998 年被列为年度自然科学领域十大进展之一，目前在实际应用方面，已广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督
2、、环境检测、国防、航天等许多领域。生物信息学（bioinformatics ）是利用应用数学、信息学、统计学和计算机科学的方法研究生物学的问题。目前的生物信息学基本上只是分子生物学与信息技术（尤其是互联网技术）的结合体。生物信息学的研究材料和结果就是各种各样的生物学数据，其研究工具是计算机，研究方法包括对生物学数据的搜索（收集和筛选） 、处理（编辑、整理、管理和显示）及利用（计算、模拟） 。目前主要的研究方向有：序列比对、基因识别、基因重组、蛋白质结构预测、基因表达、蛋白质反应的预测，以及建立进化模型。生物学技术往往生成大量的嘈杂数据，与数据挖掘类似，生物信息学利用数学工具从大量数据中提取有用
3、的生物学信息。生物信息学所要处理的典型问题包括：重新组装在霰弹枪定序法测序过程中被打散的 DNA 序列，从蛋白质的 氨基酸序列预测蛋白质结构，利用 mRNA 微阵列或质谱仪的数据检验基因调控 的假说。本节主要介绍利用生物信息学来分析和处理肺炎基因芯片结果的方法。第一节 实验所需试剂与仪器1RNA 样品制备试剂与仪器 TRIzol试剂（Invitrogen life technologies） ，Biopulverizer 组织研磨器（ biospec） ，Mini-Bead-Beater-16 研磨珠均质器（biospec）2. 总RNA 纯化及质检试剂和仪器 RNeasy小型试剂盒(Qiag
4、en p/n 74904) ( Buffer RPE缓冲液RPE，Buffer RLT缓冲液RLT，RNeasy 小型离心柱)，NanoDrop ND-1000，Baseline-ZERO DNA酶（EPICENTRE, Cat. No. DB0711K）3. 标记反应试剂盒 快速Amp标记试剂盒，单标（Agilent p/n 5190-0442）4. 标记 /扩增的 RNA的纯化和标记 cDNA的质量控制试剂盒与仪器 RNeasy Mini Kit (Qiagen p/n 74104)，NanoDrop ND-10005. 杂交试剂盒与仪器 Agilent Gene Expression H
5、ybridization Kit (Agilent p/n 5188-5242):10X Blocking Agent, 10X封闭试剂, 25X Fragmentation Buffer, 25X片段化缓冲液, 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM, 2x GEx杂交缓冲液HI-RPM, 杂交室，不锈钢(Agilent p/n G2534A)。杂交室密封垫片基(Agilent p/n G2534-60003) , 杂交炉(Agilent p/n G2545A) ,安捷伦微阵列杂交室用杂交炉旋转器(Agilent p/n G2530-60029)6. 芯片洗涤试
6、剂盒与仪器 Gene Expression Wash Buffer 1 (Agilent p/n 5188-5325), Gene Expression Wash Buffer 2 (Agilent p/n 5188-5326), Magnetic stir bar (Corning p/n 401435), Magnetic stir plate (Corning p/n 6795-410), Slide-staining dish, with slide rack (Thermo Shandon p/n 121)7. 扫描仪器 Agilent Microarray Scanner (Agi
7、lent p/n G2565BA)8. Agilent Feature Extraction Software提取数据软件 Agilent Feature Extraction第二节 实验步骤一、RNA样品制备样品分组：1-3正常肺组织 (N)，4-6肺炎肺组织(F)步骤：1. 匀浆a. 组织a) Biopulverizer冰冻粉碎组织。 将BioPulverizer 置入浅盘并使用液氮充分冷却。 将预冷的组织放入研钵的孔内。 将研钵从浅容器中取出，放置在实验台，用锤子将研杵用力敲一到两下以磨碎组织（59012MS型）。 将粉碎物清出以用于进一步的匀浆或提取步骤。b) Mini-Bead-Be
8、ater-16匀浆 在2ml螺盖微量离心管中将1.0mm微珠装至一半，然后加入TRIzol和组织，注意要将微量离心管装满。*尽量排除管内的空气。*在匀浆过程中要使用带O形圈的螺盖微量离心管以免产生气雾。*确保在旋上螺盖时口上无微珠。 将1 到 16个微量离心管放在架子上。 *如需离心，则需要将它们对称排列。* 拧上黑色塑料盖子直至接触到微量离心管管盖顶部。*用手紧固盖子以固定好瓶子。不要过紧。 依样品类型定时。启动机器。b. 贴壁细胞直接在3.5cm直径培养皿里加入 1ml TRIzol试剂以裂解细胞，并用移液管吹吸细胞裂解液几次。TRIzol试剂的加入量由培养皿的面积（1ml每平方厘米）而非
9、细胞的量决定。c. 悬浮细胞细胞离心的沉淀加入TRIzol试剂并用移液管反复吹吸以裂解细胞。每5-10 106动物植物或酵母细胞或每1 107细菌细胞使用1ml的TRIzol试剂。在TRIzol试剂加入前不要洗涤细胞以免增加mRNA降解的可能。破碎一些酵母和细菌的细胞也可能需要匀浆。2. 两相分离已加TRIzol的样品于15到30C放置5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每1 ml的TRIzol试剂匀浆的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15 到30C孵育2到3分钟。4C下12,000 g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的
10、水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIzol 试剂的60%。3. RNA沉淀将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1 ml TRIZOL试剂的此时加0.5 ml的异丙醇。混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C 12,000 g离心10分钟。此时离心前不可见的 RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。4. RNA清洗移去上清液，每1 ml TRIzol试剂匀浆的样品中加入至少1 ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4C 7,500 g离心5 分钟。5. 重新溶解RNA沉淀最后，空气中干燥RNA沉淀5-
11、10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260 / 280比值将小于 1.6。溶解RNA 时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60C孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于- 70C。二、总RNA纯化及质检操作前注意事项：1. RPE缓冲液是以浓缩液的形式提供的，第一次使用前，按瓶上所述加入4 倍体积的96-100%乙醇配成工作溶液。步骤：1. 将以下组分在微量离心管中混合：重新溶解的 RNA 85ul10反应缓冲液 10ulBaseline-ZERO DNA 酶 5ul无 RNA 酶的水 X ul总体积 100u
12、l2. 37C孵育30分钟。3. 加入350 l 缓冲液RLT，混匀。4. 加入250 l 乙醇 (96100%)，吸打混匀。无需离心，立即转入步骤 5。5. 把700 微升的样品加入到安装在2 毫升收集管上的RNeasy 小型离心柱中，小心地盖上盖子，8000 x g 离心 15s，弃去流体。6. 在RNeasy 小柱中加入500 l缓冲液RPE ，小心地盖上盖子，8000 x g离心15s，洗涤RNeasy膜，弃去流体。7. 再次加入500 l缓冲液RPE，盖上盖子，8000 x g离心2min洗涤RNeasy膜。8. 把RNeasy 柱放在一新的2ml的收集管中，用过滤法去除旧的收集管，
13、全速离心1分钟。9. RNeasy柱转移到一新的1.5毫升的离心管中，吸取适量无RNA 酶的水（请参考“RNA-QC ”报告）直接加入到RNeasy 膜中。盖上管盖， 8000 x g离心1分钟、洗脱。10. RNA定量和质量控制（请参考“RNA-QC”报告）三、标记反应操作步骤：1. 将1g总RNA加入到一支1.5ml的微量离心管中。2. 加入1.2l的T7 Promoter引物3. 加无核酸酶的水至总反应体积11.5l4. 将反应体系置65C循环水浴10分钟使引物和模板变性。5. 将反应体系置冰上并静置5分钟。6. 将下表所列组分按顺序加入并轻轻混合以配置成cDNA Master Mix，
14、置冰上，现配现用。Volume(ul) per reaction5First Strand Buffer 40.1M DTT 210mM dNTP mix 1MMLV-RT 1RNaseOut 0.5Total volume 8.57. 将每样品管在微量离心机中简单甩一下，使管壁和管盖上的溶液离心下来。将离心管放回冰上。8. 在每样品管中加入8.5l的cDNA Master Mix并上下吹吸混合。9. 将样品于40C循环水浴中温育2小时。10. 将样品转至65C循环水浴中温育 15分钟。11. 将样品转至冰上并静置5分钟。12. 将每样品管在微量离心机中简单甩一下，使管壁和管盖上的溶液离心下来
15、。13. 将下表所列组分按顺序加入并在室温轻轻吹吸混合以配置成Transcription Master Mix，现配现用。Volume(ul) per reactionNuclease-free water 15.34X Transcription Buffer 200.1 M DTT 6NTP mix 850% PEG 6.4RNaseOUT 0.5Inorganic pyrophosphatase 0.6T7 RNA Polymerase 0.8Cyanine-3-CTP 2.4Total volume 6014. 在每样品管中加入60l Transcription Master Mix。
16、轻轻吹吸混匀。15. 将样品于40C循环水浴中温育 2小时。四、标记/扩增的RNA的纯化和标记cDNA 的质量控制操作步骤：1. 加入20l无核酸酶的水至cRNA样品中至总体积100l2. 加入350l的 RLT缓冲液并吹吸充分混匀3. 加入250l的乙醇（纯度 100%）并吹吸完全混匀。不要离心。4. 将700l的cRNA样品加入到一支放在 2ml收集管内的RNeasy小柱中， 样品在4C以1,3000 rpm离心30秒。弃流穿液与收集管。5. 将RNeasy 柱转移至一新收集管并在其中加入500l的RPE 缓冲液 (含乙醇)。样品在4C以1,3000 rpm离心30秒。弃流穿液，收集管则重
17、复使用。6. 将RNeasy 柱中再加入300l的RPE 缓冲液( 含乙醇)。样品在4C以1,3000 rpm离心60秒。弃流穿液与收集管。7. 将RNeasy 柱转移至一支新的1.5ml收集管中，直接在RNeasy滤膜上加入适量的无RNA酶的水（请参考报告”Labeling Efficiency-QC”）以溶解纯化的 cRNA样品。静置 60秒，然后在4C以1,3000 rpm离心30秒。8. 将含有cRNA样品的流穿液放置在冰上，弃 RNeasy柱。9. T每样品取1.5l用NanoDrop ND-1000测定产物量特异性活性(请参考报告”Labeling Efficiency-QC”)
18、在主菜单上选择MicroArray Measurement。进入Sample Type pull-down菜单选择DNA-50 。 使用1.5l 1x的标记液为仪器调零。 使用1.5l纯化的标记的基因组DNA定量。测定A260nm(DNA)和A550nm(cyanine 3)吸光值。 标记的基因组DNA的特异性活性(pmol染料每g 基因组DNA) 可用下式算得：(Concentration of Cy3)Specific Activity = = pmol Cy3 per g cRNA(Concentration of cRNA) * 1000Cy3的浓度特异性活性 = = pmol Cy3
19、 每 g cRNAcRNA的浓度*1000* I如果量小于1.65 g且特异性活性小于9.0 pmol Cy3每g cRNA，则不要进行杂交。再次制备cRNA五、杂交步骤:1. 在10X封闭试剂冻干瓶中加入500 l无核酸酶的水，振荡混匀。2. 水浴平衡在60C3. 每个微阵列实验，将以下组分按下表所列顺序依次加入到1.5ml无核酸酶的微量离心管中。Amountcyanine 3-labeled, linearly amplified cRNA 1.6510X Blocking Agent 11ulNuclease-free water ul25X Fragmentation Buffer 2
20、.2ulTotal volume 55ul4. 在振荡混合器上充分而轻柔的混匀。5. 在60C孵育整30分钟以片段化RNA。6. 在芯片上加入55ul 2x GEx杂交缓冲液HI-RPM 以终止片段化反应。7. 仔细吹吸以充分混合。注意不要造成气泡。勿在振荡混合器上混匀，在振荡混合器上混合会造成气泡。8. 室温下以13,000 rpm离心1分钟使样品从壁上和盖子上离下来并帮助减少气泡。9. 将样品置冰上并尽快上样至芯片。10. 将干净的密封垫片基标记朝上与杂交室基座的矩形截面对准装入安捷伦SureHyb杂交室基座。确保密封垫片基与杂交室基座完全平齐不翘起。11. 慢慢将100l 杂交样品以一种
21、 “边拖边装”的方式分配到密封孔中12. 将芯片慢慢放在SureHyb密封垫片基上，这样 “Agilent”标记条码朝下而数字条码朝上。确认这种三明治排列。13. 将SureHyb杂交室盖在三明治结构的片基上并滑动夹子将两片组装起来。14. 将夹子手工紧固到杂交室上。15. 垂直旋转装好的杂交室到密封圈上，估计气泡的活动性。16. 将装好的片基杂交室放入杂交炉烤室内，设定至65C，设定杂交旋转器至10 rpm。17. 65C杂交17小时。六、芯片洗涤操作步骤:1. 预热足够体积的Gene Expression Wash Buffer 2至37C。2. 把片基支架与搅拌子装在染色盘上。3. 将染
22、色盘连同片基支架与搅拌子一起转移到磁力搅拌盘上。4. 用100% 乙腈灌满染色盘。5. T打开磁力搅拌盘并调节速度到4（中速）。6. 洗5分钟。7. 弃乙腈至合适的地方。8. 重复步骤2到步骤7 。9. 在排气通风橱风干染色盘。10. 用Milli-Q水清洗所有的盘，支架，和搅拌子。11. 室温下用Gene Expression Wash Buffer 1完全灌满芯片染色盘#112. 将一片基支架放入芯片染色盘#2。放入一个搅拌子。室温下用足量Gene Expression Wash Buffer 1灌满芯片染色盘#2以淹没支架，将该盘放在磁力搅拌盘上。13. 将空盘#3放在搅拌盘上并放入一个
23、磁力搅拌子。等到第一步洗涤开始后才加入预热的(37C) 。14. 从温育中取出杂交室并开始计时。记录杂交过程中是否产生了气泡以及是否所有的气泡均可自由转动。15. 杂交室拆卸准备。a) 将杂交室组件放在平面上，逆时针转动松掉拇指夹。b) 滑动取下夹具并取下杂交室盖c) 带手套从杂交室基座上捏住芯片末端取下芯片-密封垫三明治结构。尽快将其转移至芯片染色盘#1并在此过程中保持芯片数字条码朝上。d) 不松开手上的芯片，将芯片-密封垫三明治结构淹没到装有Gene Expression Wash Buffer 1的芯片染色盘#1中。16. 当三明治结构完全淹没到Gene Expression Wash
24、Buffer 1后，仅从条码端撬开三明治结构。a) 用镊子的一个钝头在片基之间滑动。b) 轻轻将镊子向上或向下转动以分开片基。c) 使密封垫滑落到染色盘的底。d) 取下芯片并将其在室温下放入到装有Gene Expression Wash Buffer 1的芯片染色盘#2 中的片基支架上。17. 当一组芯片全部放在芯片染色盘#2中的片基支架上后，使用设定4搅拌1分钟。18. 在此洗涤步骤中，从37C水浴中取出 Gene Expression Wash Buffer 2并倒到芯片染色盘#3中。19. 将片基支架转移至装有containing Gene Expression Wash Buffer
25、2的升温的芯片染色盘#3 中。使用设定4 搅拌 1分钟。20. 慢慢取出芯片支架，芯片上的液滴尽量要少。取出芯片支架应在5-10秒钟。21. 立即扫描芯片以防止在环境中氧化剂对信号强度的影响。七、扫描操作步骤：1. 将芯片装在芯片托上。2. 将装好的芯片托放入到扫描仪传送带上。3. 确认单色扫描的扫描设定：ParametersScan region Scan Area (61 x 21.6 mm)Scan resolution (m) 55m scanning mode Single PasseXtended Dynamic range (selected)Dye channel GreenG
26、reen PMT XDR Hi 100% XDR Lo 10%4. 点击扫描控制主窗体上的Scan Slot m-n，字母m表示第一个芯片所在的开始的槽，而字母n 表示最后一个芯片所在的结束槽。八、用Agilent Feature Extraction Software提取数据操作步骤：1. 打开Agilent Feature Extraction (FE) 软件。2. 将待提取的图像文件(.tif)加入到FE Project。3. 设定FE Project的属性。4. 检查提取设定参数。5. 选择File Save As 和浏览以保存FE Project(.fep)至所需位置。6. 选择Pr
27、oject Start Extracting并导出数据到文本。实验流程：第三节 实验结果1.总RNA质控结果 提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳分析，可以观察到18S、28S两条条带，有较好的完整性 (图1)；RNA样本经紫外分光光度计测定OD260/OD280值均在1.9-2.1之间 (表1)表1 RNA定量和定性分析样品 RNA 抽取.质检随机引物标记芯片杂交洗涤，染色，扫描图像采集和数据分析Sample ID OD260/280 Ratio OD260/230 Ratio Conc. (ng/l) Volume (l) Quantity (ng) QC resultPass or Fail1
28、 1.96 2.40 550.80 10 5508.00 pass2 2.01 2.42 999.21 10 9992.10 pass3 1.99 2.42 700.44 10 7004.40 pass4 2.00 2.41 703.95 10 7039.50 pass5 1.98 2.39 601.95 10 6019.50 pass6 2.01 2.32 751.78 10 7517.80 pass*OD.A260/A280比值（1.8-2.1）应该接近2.0保证RNA 的纯度.OD.A260/A230比值大于1.8图1 总RNA电泳分析2. 差异表达基因筛选 基于基因芯片的原理，我们得到
29、的数据是每个基因对应探针的荧光强度，为了消除生物学系统误差，经过修正，我们得到最终的Normalized值 (表2)，然后在 Excel中取两组数据的比值Fold-change(图2)，即normalized intensity of treat/normalized intensity of control，即F/N。根据数据的信息量，人为设定筛选标准：Fold-change2或5或10或1，|5-fold change|1，|10-fold change|1，界定为倍数差异。2-Fold change=log2（normalized intensity of treat/normalize
30、d intensity of control），5-Fold change=log5 （normalized intensity of treat/normalized intensity of control），10-Fold change=lg（normalized intensity of treat/normalized intensity of control）。Lane 1: Total RNA of sample 1Lane 2: Total RNA of sample 2表2 正常肺组织和肺炎肺组织差异表达基因部分数据Group-Normalized IntensityN(no
31、rmalized) F(normalized)Gene Name708.228703 298.436450 PER20.521212.646933 576.614820 BAHD1878.467253 381.553203 KIAA1026524.253497 168.587817 C11orf211784.979700 367.486113 FZD47857.677800 2993.335933 HEG1918.384633 188.512253 SEMA6A448.655283 207.171807 KIAA1450678.663100 282.442587 PLCE15593.95323
32、3 228.511870 AGER1179.106667 247.403737 AKNA1781.639533 565.994190 ATF3755.539400 222.343023 KIAA2002544.475217 221.416447 N/A1002.827517 270.869663 OTUD11611.357933 792.378363 RXRB1086.207667 340.754660 GIT13606.139200 518.236183 ALPL830.409683 307.914230 CUGBP1877.365277 222.736603 LST1693.287933
33、324.037160 LST13488.770900 1569.500533 LILRB1332.552350 131.972063 LILRB12304.095867 780.259453 CFLAR960.115020 437.600890 LILRB3866.059433 284.219620 TNFRSF10C图2 F/N比值本文以2-5 倍变化的基因，介绍如何做heat map。选中F/N这列数据，“开始”-“排序和筛选”-“筛选 ”-“数字筛选 ”-“介于”，即筛选出满足条件的基因图3 筛选图4 数字筛选3.做 heat map 图 由于 N(normalized)，F(norma
34、lized)数值较大，因此所有的数据均除以 1000 后，在以 2 为底，取对数。选中数据， “开始”-“条件格式”- 色阶-“其他规则”-按图 6 设置规则-“ 确定”，得到图 7，下一步去掉里面的数据选中数据，鼠标右键选择“ 设置单元格格式” “数字” “自定义”半角状态的分号“;”（图 8） ，即得到所谓的热图图 5 打开色阶设置图 6 设置色阶规则图 7 图 8 图 9 热图第四节 结果分析为了解参与肺炎发病过程的基因变化，我们应用现阶段较为成熟的基因芯片技术来分析基因的表达水平。我们发现肺炎标本相对正常肺组织上调 2-5 倍的基因有 1231 个，下调 2-5 倍的基因有 1685
35、个(表 3). 上调或下调的基因使用Go 分析，做功能分类，再结合上调或下调的基因水平，最终选择可能的关键靶基因，进而往下研究该基因的功能以及调控机制等。本实验成功地将生物芯片技术和生物信息学完美的结合，为处理芯片结果提供了方法。表 3 肺炎下调和上调 2-5 倍的基因表达荧光强度值F vs N_down F vs N_upN(normalized)F(normalized)Gene NameN(normalized)F(normalized) Gene Name708.228703 298.436450 PER2 167.130373 449.269827 CLCN31212.646933
36、576.614820 BAHD1 251.518353 692.628853 CGI-09878.467253 381.553203 KIAA1026 293.551423 709.893110 AHCTF1524.253497 168.587817 C11orf21 1541.180033 4579.679133 CCT6A1784.979700 367.486113 FZD4 3280.387433 7173.687800 C18orf107857.677800 2993.335933 HEG1 204.278343 491.264177 ACP6918.384633 188.512253
37、 SEMA6A 161.726673 477.018957 PTK9448.655283 207.171807 KIAA1450 680.290587 1612.569733 MGAT5B678.663100 282.442587 PLCE1 710.094577 1957.932100 TAF21179.106667 247.403737 AKNA 148.930183 367.811710 CASK1781.639533 565.994190 ATF3 286.756860 651.940423 GMDS755.539400 222.343023 KIAA2002 168.762913 4
38、16.377990 CSNK1G3544.475217 221.416447 N/A 641.010833 1868.711667 SEL1L1002.827517 270.869663 OTUD1 232.095320 601.694743 LYPLA11611.357933 792.378363 RXRB 1207.086167 2423.328800 FLNC1086.207667 340.754660 GIT1 433.770100 1834.349200 N/A830.409683 307.914230 CUGBP1 475.683410 1222.616467 GPR89A877.
39、365277 222.736603 LST1 460.361423 930.370733 UCHL5693.287933 324.037160 LST1 416.960733 1936.623967 GLS3488.770900 1569.500533 LILRB1 587.135010 1325.902700 C14orf100332.552350 131.972063 LILRB1 714.617630 1464.055467 PSENEN2304.095867 780.259453 CFLAR 2365.571500 4835.081500 MRPS21960.115020 437.60
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