发酵工程 产物的提取与精制.doc

1、第十二章 产物的提取与精制第一节 概论一、下游加工过程在发酵工程中的地位1，下游加工过程的定义发酵产品系通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得。从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程(Down stream processing)。它由一些化学工程的单几操作组成，但由于生物物质的特性，有其特殊要求，而且其中某些单元操作一般化学工业中应用较少。2，地位传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸)，分离和精制部份占整个工厂投资费用的 60%。对重组 DNA 发酵、精制蛋白质的费用可占整个生产费用的80%90%。二、发酵下游加工过程的特点培养液(或发酵液)

2、是复杂的多相系统，含有细胞、代谢产物和末用完的培养基等。分散在其中的固体和胶状物质，具可压缩性，其密度又和液体相近，加上粘度很大，属非牛顿性液体，使从培养液中分离固体很困难。培养液中所欲欲提取的生物物质浓度很低，但杂质含量却很高，特别是利用基因工程方法产生的蛋白质常常伴有大量性质相近的杂质蛋白质。另一个特点是欲提取的生物物质通常很不稳定、遇热、极端 pH、有机溶剂会引起失活或分解。发酵或培养都是分批操作、生物变异性大，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定的弹性。三、分离过程的机理与分离操作1，物理性质（1）力学性质：重力、离心力、筛分；（2）热力学性质：状态变化、相平衡；（3）传质性质：粘度

3、、扩散、热扩散；（4）电磁性质：电泳、电渗析、磁化；2，化学性质（1）化学热力学；化学平衡；（2）反应动力学：反应速率；（3）光化学性质：激光激发、离子化；3，生物学性质（1）分子识别：生物亲和作用、生物学识别；（2）输送性质：生物膜输送；（3）反应、响应、控制：酶反应、免疫系统。生物操作机理及其分离机理单元操作 分离机理 分离对象举例膜分离 微滤超滤反渗透透析电渗析渗透气化压力差、筛分压力差、筛分压力差、筛分浓度差、筛分电荷、筛分汽液相平衡、筛分菌体、细胞蛋白质、多糖、抗生素糖、氨基酸盐、蛋白质氨基酸、有机酸乙醇萃取 有机溶剂萃取双水相液膜萃取反胶团萃取超临界萃取液液相平衡液液相平衡液液相平

4、衡液液相平衡相平衡有机酸、抗生素蛋白质、抗生素氨基酸、有机酸、抗生素氨基酸、蛋白质香料、脂质层析 凝胶过滤层析反相层析离子交换层析亲和层析疏水相互作用层析聚焦浓度差、筛分分配平衡电荷、浓度差生物亲和作用疏水作用电荷、浓度差脱盐、分子分级甾醇、维生素、肽蛋白质、氨基酸、抗生素、核酸、有机酸蛋白质、核酸蛋白质蛋白质电泳 凝胶电泳等电点电泳等速电泳区带电泳筛分、电荷筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差蛋白质、核酸蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸蛋白质、核酸离心 离心过滤离心沉降超离心离心力、筛分离心力离心力菌体、菌体碎片菌体、细胞蛋白质、核酸、糖类四、发酵工业下游技术的一般工艺过程下游

5、加工过程由各种化工单元操作组成。由于生物产品品种多，性质各异，故用到的单元操作很多，其中如蒸馏、萃取、结晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单元操作，理论比较成熟，而另一些则为新近发展起来的单元操作，如细胞破碎、膜过程和色层分离等，缺乏完整的理论，介于两者之间的有离子交换过程等。1， 一般工艺过程一般说来，下游加工过程可分为 4 个阶段：培养液(发酵液)的预处理和固液分离；初步纯化(提取) ；高度纯化(精制) ；成品加工。2，工艺过程的划分：发酵的下游加工过程可以下过程：（1）预处理和固液分离 ：目的是除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质。（2）初步分离 ：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后

6、道精制工序创造有利条件。（3）高度纯化 ：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。（4）成品制作 ：成品形式由产品的最终用途决定。 3，选择下游加工工艺的原则：（1）是胞内产物还是胞外产物 （2）原料中产物和主要杂质浓度 （3）产物和主要杂质的物理化学特性及差异 （4）产品用途和质量标准 （5）产品的市场价格 （6）废液的处理方法等 第二节 发酵液的预处理和固液分离发酵液预处理和固液分离的目的：分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。一、 发酵液的预处理采用理化方法设法增大虚浮液中固体粒子的大小、或降低粘度，以利于

7、过滤。去除会影响后续提取的高价无机离子。（一）预处理的方法高价无机离子的去除方法；杂蛋白质的去除；发酵液的凝聚和絮凝。1，高价无机离子的去除方法（1）钙离子，可用草酸。草酸溶解度较小，故用量大时，可用其可溶性盐，如草酸钠。反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液(也称为原液)质量。但草酸价格较贵，应注意回收。如四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，在 60下反应生成草酸铅。后者在 9095下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。（2）镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提取。（3）铁离子，可加入黄血盐，使形

8、成普鲁士蓝沉淀。2，杂蛋白质的去除方法（1）热变性（2）沉淀（3）大幅度改变 pH3，发酵液的凝聚和絮凝凝聚和絮凝的概念，过去常常混淆，现已趋于明确区分开来。凝聚是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。（1）机理电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使伦敦 范德华 (LondonVander waals)吸引力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子，或在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过

9、滤。（2）方法在稀溶液中加入电解质以促进凝聚和絮凝。试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。（3）常用的絮凝剂聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠（4）影响絮凝的因素虽然絮凝的机理目前还不十分清楚，但是已知道絮凝效果与絮凝剂的加量、分子量和类型，溶液的 pH，搅拌速度和时间等因素有关。在絮凝过程中，常需加入一定的助凝剂以增加絮凝效果。料液中，絮凝剂浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量反而会引起吸附饱和，在每个胶粒上形成覆盖层而使胶粒产生再次稳定现象。如淀粉酶发酵液的絮凝试验中，絮凝剂加量对絮凝效果(滤速)的影响如下图所示。适宜的加量通常由实验得出，虽然高分子絮凝剂分

10、子量提高，链增长，可使架桥效果明显，但是，分子量不能超过一定的限度，因为随分子量提高，高分子絮凝 剂的水溶性降低，因此分子量的选择应适当溶液 pH 的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，由于链节上相邻离子基团间的电排斥作用，而使分子链从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。例如，采用碱式氯化铝和阴离子聚丙烯酰胺搭配使用的混凝方法处理 2709 碱性蛋白酶发酵液，发酵液 pH 对阴离子聚丙烯酰胺絮凝效果的影响如下图所示。可见 pH 适当提高能增大滤速，这是因为聚丙烯酰胺分子链上的羧基解离程度提高，而使其达到较大的伸展程度，发挥了最佳的架桥能力。絮凝技

11、术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量二、 发酵液的过滤微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。在过滤操作中，要求滤速快，滤液澄清并且有高的收率。1，影响过滤速度的因素过滤速度和以下因素有关菌种；发酵条件（培养基的组成、未用完培养基的数量、消沫油、发酵周期、 ） 。（1）菌种对过滤速度影响真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可达 10m，发酵液容易过滤，不需特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过

12、滤机过滤。放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。如链霉素发酵液菌丝仅0.51.0m 左右，还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因准，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。（2）培养基的组成对过滤速度影响用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难；发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养基也会使过滤困难。（3）发酵周期对过滤的影响正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞自治后的 分解产物一股很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但严重影响发

13、酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造成成品质量降低。2，改善过滤性能的方法发酵工业中用于改善发酵液过滤性能的方法通常有：等电点、蛋白质变性、吸附、凝聚和絮凝、加入助滤剂、直接在发酵液中形成填充-凝固剂、酶解作用。（1）过滤助剂助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。过滤助剂可解决两个问题滤饼的可压缩性问题小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转鼓真空过滤预覆盖层内部。使得预覆盖层的部分孔被堵塞，影响了渗透性。加入助滤剂可以解决这一问题常用的过滤助剂有：硅藻土、珍珠岩、磨碎的木浆、淀粉助滤剂的加入有两种方法：在滤布上预先铺一层助滤剂(12mm) ，该方法，会使滤速降低

14、，但滤液透明度直接加入发酵液中（助滤剂的用量，有一条经验规则可供参考，即助滤剂用量若等于悬浮液中固体含量时，滤速最快。 ） 。（2）填充-凝固剂改善过滤性能较好的方法是加入一些反应剂，它们能相互作用，或和某些溶解性盐类发生反应生成不溶解的沉淀(CaSO 4，AlPO 4 等)。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身即可作为助滤剂，并且还能使胶状物和悬浮物凝固，如新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷酸钙可作为填充-凝固剂。一方面作为助滤剂，另一方面还可使某些蛋白质凝固。又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成的磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固。多余的磷酸根离子，还能除去钙、

15、镁离子。并且在发酵液中不会引入其它阳离子而影环环丝氨酸的离子交换吸附。正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速度提高 310 倍。（3）酶解作用如发酵液中有不溶解的多糖存在则最好用酶将它转化为单糖，以提高过滤速度。例如万古霉素用淀粉作培养基，加入淀粉酶后，能使过滤速度加快。3，固-液分离设备的选择 不同性状约发酵液应选择不同的固-液分离设备。常用于发酵液的分离设备有：板框压滤机、鼓式真空过滤机、离心沉降分离机 （1）板框压滤机板框压滤机的过滤面积大，过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差，故对不同过滤特性的发酵液适应性强，同时还具有结构简单，价格低，动力消耗少等优点，因此，

16、目前，国内广泛被采用。但是，这种设备不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非生产的辅助时间长(包括卸框、卸饼、洗滤饼，洗滤布，重新压紧板框等)，阻碍了过滤效率的提高。自动板框过滤机是一种较新型的压滤设备，它使板框的拆装，滤渣的脱落卸出和滤布的清洗等操作都能自动进行，大大缩短了非生产的辅助时间和减轻了劳动强度。对于菌体较细小，粘度较大的发酵液，可加入助滤剂或采用絮凝等方法预处理后进行压滤。对于难过滤的枯草杆菌发酵液，可设计一种特别薄的板框以减小滤饼的阻力。另外，也可采用带有橡皮隔膜的压滤机，过滤结束时，在滤板和橡皮膜之间通入压缩空气来压榨滤饼，将液体挤压出来。其优缺点概括如下：优点：板

17、框压滤机的过滤面积大；过滤推动力(压力差) 能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差；结构简单，价格低；动力消耗少等优点。缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大；卫生条件差；非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。 （2）鼓式真空过滤机鼓式真空过滤机能连续操作，并能实现自动化控制，但是压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。例如，过滤青霉素发酵液的速度可达 800L/(m2.h)。而对菌体较细或粘稠的发酵液不太适用。一种较好的解决办法是过滤前在转鼓面上预铺一层助滤剂，操作时，用一把缓慢向鼓面移动的刮刀将滤饼连同极薄的一层助滤剂一起刮去，这样使过滤面积不断更新，以维持正常的过滤速度。放线菌发酵

18、液可采用这种方式过滤。其优缺点概括如下：优点：能连续操作；能实现自动化控制缺点：压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。 （3）离心分离 优点：分离速度快，效率高； 操作时卫生条件好等优点； 适合于大规模的分离过程。 缺点：投资费用高， ； 能耗较大。 三、微生物细胞的破碎微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。还有许多是存在于细胞内，例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等，称为胞内产物。对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后

19、，再进行细胞碎片的分离。1，微生物细胞的破碎技术常见的细胞破碎方法有：机械方法（球磨机、高压匀浆器、X-press 法、超声波破碎）和非机械方法（酶解法、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法、化学法）（1）球磨机研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。（2）高压匀浆器采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂各种菌体一次通过高压匀浆器的破碎率菌体 压力（Mpa） 破碎率（%

20、）面包酵母啤酒酵母大肠杆菌解肢假丝酵母5355535562616743（3）X-press 法一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25C 至-30 C 形成冰晶体，利用 500 MPa 以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，该法对冷冻融解敏感的生化物质不适用。 （4）超声波法细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。对于不

21、同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果级差。该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。 （5）酶解法利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的 -1，4 糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。（6）自溶作用是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。影响自溶过程的因素有温度、时间、p

22、H 缓冲液浓度、细胞代谢途径等。自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。 （7）渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。 （8）冻结-融化法将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的硫水键结构破裂，从而增加了

23、细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。（9）干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。（10）化学法用酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，这些试剂容易引起生化物

24、质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。 2，破碎方法的选择选择合适的破碎方法需要考虑下列因素：（1）细胞的数量；（2）所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性；（3）要达到的破碎程度及破碎所必要的速度，（4）尽可能采用最温和的方法；（5）具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。 第三节 沉淀法沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法。由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。沉淀法由于成本低、收率高(不会使蛋白质等大分子失活)、浓缩倍数高和操

25、作简单等优点，是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：盐析法；等电点沉淀法；有机溶剂沉淀法；非离子型聚合物沉淀法；聚电解质沉淀法；高价金属离子沉淀法。一、盐析法1，盐析的定义在蛋白质溶液中加入中性盐使其沉淀析出的过程。2，机理通过破坏蛋白质分子表面水膜或中和蛋白质分子表面水膜使蛋白质凝聚沉淀。3，盐析法的优点成本低，不需要什么特别昂贵的设备；操作简单，安全；对许多生物活性物质具有稳定作用。4，盐析法的缺点沉淀物中含有大量的盐析剂。5，盐析用中性盐的选择（1）常用的中性盐常用的中性盐有 MgSO4、 (NH4)2SO4、Na 2SO4、 NaH2PO4

26、。（2）选择中性盐应注意的问题使酶沉淀完全、收率高；且有利于酶的提纯，而本身又易去除。对酶无毒性，应用不受影响。价格低廉。废水处理容易。 6，盐析剂用量的确定通常采用实验的方法确定。7，盐浓度的表示法盐析法中的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱和的溶液成为 100%饱和度。8，蛋白质的浓度与盐析的关系利用盐析方法分步分离蛋白质各组份和溶液中蛋白质实际浓度有很大关系。LogC1-K sI1 这里的 I1 是蛋白质开始沉淀时的离子强度。 但如果这种蛋白质在溶液中含量较低(设其浓度为 C2)，则需要加人较多的中性盐，蛋白质才开始沉淀。(设此时离子强度为 I2)应写作：LogC2-K sI22Log（

27、C 1/C2）K s（I 2-I1）9，离子强度和类型对盐析的影响几种蛋白质析出时所需硫酸铵的离子的强度在低离子强度下，许多蛋白质比在纯水中的溶解度大大增加，但当溶液中离子强度不断增加时，各离子之间及离子与溶质分子之间相互竞争水分子，结果导致溶质的溶解度渐渐减少，产生盐析现象。一般来说离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。但蛋白质的盐析现象比一般有机分子复杂一些，蛋白质分子大，而且有许多表面电荷，这些表面所带电荷常随着周围离子和溶剂分子排列秩序的影响而不断变化着，蛋白质分子内还有许多相互作用的基团，这都造成了许多经典理论不能十分完美地解释蛋白质盐析的原因。几种蛋白质在不同离子强度下的盐析效应见上图

28、，从图中可以看出，当硫酸按饱和度达到 20%时，纤维蛋白原首先析出，饱和度增至 2833%时，血红蛋白析出，饱和度再增至 3335%时，拟球蛋白析出，饱和度至 50%以上，清蛋白析出，饱和度最后达到 80%时，肌红蛋白析出。可见不同蛋白质发生盐析时所需求的离子强度是不同的。所以用不同离子强度分步盐析的方法，就可以分离混合物中各种组份。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度，顺次进行。每一组份被盐析出来后。经过固液分离(冰冻离心或过滤)，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组份盐析出来。离子强度的大小对蛋白质的溶解度起着决定性的影响。但在同样的离子强度下，离子种类的不同对蛋白

29、质溶解度的影响也不同。下图所示是几种不同电解质下，一氧化碳血红蛋白溶解度曲线。图中不同离子种类对蛋白质溶解度的影响，可以从 Hofmeister 系列理论中获得解释： 即离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱。单价盐如 KCl，NaCl 的盐析效果一般比较差。蛋白质在不同电解质中的盐析效应从图可知不同盐类对同一蛋白质的盐所效应具有不同的“Ks”值，Ks 值可由各种益的盐析曲线的斜率表示。它们的减少顺序是：磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁。按照 Hofmeister 系列，镁离子比铵离子小，但实际上硫酸铵的盐析效应比硫酸镁好，主要是镁离子在同离子强度下产

30、生了一层颇大的离子雾，从而减少了它的盐析效应。10，pH 对盐析的影响一般地说，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大；如果所带的电荷减少至接近于零时溶解度最少，我们称此时的 pH 值为该蛋白质的等电点 (PI)。改变 pH 或特异地加入与蛋白质极性基团结合的离子(叫反离子)即可改变蛋白质的带电性质，也就是改变了蛋白质的溶解度。下图是在不同 pH 的浓磷酸盐缓冲液下血红蛋白的溶解度曲线。从图中曲线可见，蛋白质在不同的 pH 下有着不同的溶解度，远离等电点处蛋白质的溶解度最大，等电点处溶解度最小。因此在盐析时常选择溶液 pH值在该蛋白质等电点附近。但必须注意在水中或稀盐溶液中测得的蛋白质等电点与高

31、盐浓度下所测的结果是不同的。需根据实际情况调整 pH 值至蛋白质溶解度最低处，才能使盐析获得更好效果。11，温度对盐析的影响温度是影响溶解度的重要因素，对于许多无机盐和小分子的有机化合物，温度升高，溶解度也相应增大。但对于蛋白质、酶等生物大分子在高离子强度溶液中，温度的升高，它们的溶解度有时不但不升高。反而减少。许多蛋白质在高离子强度溶液中 25C 时的溶解度比 4C 时溶解度明显地减少。如图 35 所示。但必须指出这种温度升高溶解度的下降现象只有在高离子强度下才能发生。在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度大多数在一定范围内是随着温度增加而增加的。在一般情况下，蛋白质的盐析温度要求不严格，可以在

32、室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶，要求在低温 0-4C 下操作。以避免活力的丧失。二、有机溶剂沉淀1，原理有机溶剂的沉淀作用主要是降低水溶液的介电常数，溶液的介电常数减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加从而使溶解度减少。2，优点分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易。在生化制备中应用比盐析法广泛3，缺点容易引起蛋白质变性失活，操作常需在低温下进行。且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。4，常用的有机溶剂常用的有机溶剂有：乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇。5，有机溶剂的选择 有机溶剂沉淀蛋白质的能力随蛋白质种类及有机溶剂的

33、种类而异。对曲霉淀粉酶而言，有机溶剂沉淀能力，依次为丙酮异丙醇乙醇甲醇。这个顺序还受温度、pH、盐离子浓度的影响。丙酮沉淀能力最强，但挥发损失多，价格相对较高，工业上一般采用乙醇。 6，有机溶剂沉淀的影响因素影响有机溶剂沉淀的因素有：温度、蛋白的浓度、pH 、金属离子、离子强度。（1）温度对有机溶剂沉淀的影响蛋白质在有机溶剂中对温度反应特别敏感，温度稍高即发生变性。因此，加入的有机溶剂都必须预冷至较低温度，操作要在冰浴中进行，同时加入有机溶剂必须缓慢而又不断搅拌以免溶剂局部过浓。温度的高低会影响到已沉淀的蛋白质复溶。（2）蛋白质浓度对有机溶剂沉淀的影响低浓度样品使用有机溶剂的量大但共沉作用小，

34、利于提高分离的效果；高浓度样品可以节省有机溶剂，减少变性危险，但共沉作用大，分离效果较差。（3）pH 值对有机溶剂沉淀的影响在蛋白质结构稳定范围下选择溶解度最低处的 pH 值，有利于提高沉淀效果。适宜的 pH 值可大大提高分离的分辨能力（4）金属离子对有机溶剂沉淀的影响一些多价离子如 Zn2 +和 Ca 2+在一定的 pH 值下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在水中或有机溶剂中的溶解度都大大降低，而不影响蛋白质的活性。（5）离子强度对有机溶剂沉淀的影响离子强度是影响溶质在有机溶剂及水混合液中溶解度的一个重要因素，盐的浓度大小或太大都对分离有不利影响，对于蛋白质，在有机溶剂中盐的浓

35、度不超过 5%比较合适，使用的乙醇量也以不超过二倍体积为宜。7，有机溶剂沉淀应注意的问题（1）降低温度，能增加收率和减少蛋白质的变性。（2）所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不起作用。（3）蛋白质的分子量越大，产生沉淀所需加入的有机溶剂量越少。（4）一种蛋白质的溶解度通常会由于另一蛋白质的存在而降低。（5）沉淀的蛋白质如不能再溶解，就可能已经变性。（6）对很多酶，丙酮加量在 20%50%之间，就能产生沉淀。（7）接近等电点时，以引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。（8）当溶剂量达到 50%时，则通常只有分子量小于 15000 的蛋白质仍留在溶液中。（9）少量中性盐的存在能产生盐溶作用，增加蛋

36、白质在有机溶剂水溶液的溶解度。三、等电点沉淀法1，原理等电点沉淀法主要利用两性分子上的电中性时溶解度最低，而各种两性分子具有不同等电点而进行分离的一种方法。 两性分子在处于等电点时的 pH 值，再加上其他沉淀因素，则很易沉淀析出。2，等电点沉淀法的优缺点优点：很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，井且某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。缺点：酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低 pH 比较敏感。第四节 吸附法在发酵工业的下游加工过程中，吸附法应用于发酵产品的除杂、脱色、有毒物质和抗生素的提纯精制。应

37、用选择性吸附法分离精制的产品包括：蛋白质、核酸、酶、抗生素、氨基酸。一、吸附法的原理吸附法是利用吸附剂与杂质、色素物质、有毒物质、产品之间分子引力的差异，从而起到分离的作用。二、吸附的目的将产品吸附浓缩于吸附剂上；将杂质、色素等需要从发酵液中去除的物质吸附于吸附剂上。三、吸附法的优缺点1，优点可不用或少用有机溶剂；操作简便、安全、设备简单；生产过程中 pH 变化小，适用于稳定性较差的生化物质。2，缺点吸附法选择性差、收率不高。无机吸附剂性能不稳定，不能连续操作，劳动强度大。炭粉等吸附剂影响环境卫生。由于凝胶类吸附剂、大网格聚合物吸附剂的应用，克服了以上缺点，近年吸附法又得到重视。四、吸附的类型

38、1，物理吸附吸附剂和吸附物通过分子力(范德华力)产生的吸附。2，化学吸附化学吸附是由于吸附剂在吸附物之间的电子转移，发生化学反应而产生的，属于库仑力 范围。3，交换吸附吸附剂表面如为极性分子或离子所组成则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层。这种吸附又称为极性吸附。五、吸附剂的基本要求1，吸附剂要求颗粒密度小，表面积大，但孔隙也不能太多，否则被吸附物质不易被洗脱。2，吸附剂的颗粒大小要均匀。3，吸附剂的吸附能力要大，但不能影响洗脱。六、吸附剂的种类1，疏水或非极性吸附剂（活性炭）2，亲水或极性吸附剂（硅胶、氧化铝）3，离子交换树脂吸附剂七、 影响吸附过程的因素1，吸附剂的性质吸附剂的理化

39、性质对吸附的影响很大。吸附剂的性质与其原料、合成方法和再生条件有关。一般要求吸附容量大，吸附速度快和机械强度好。吸附剂的吸附容量除其它外界条件外，主要与比表面积有关。比表面大，空隙度高，吸附容量就越大。吸附速度主要与颗粒度和孔径分布有关，颗粒度越小，吸附速度就越快，但压头损失要增大。孔径适当，有利于吸附物向空隙中扩散。吸附剂的机械强度则影响其使用寿命。2，吸附物的性质有下列一些规则可用来预测吸附的相对量。（1）能使表面张力降低的物质，易为表面吸附；（2）溶质从较易溶解的溶剂中吸附时，吸附量较少。（3）极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。（4）对于同系列物质，吸附量的变化是有

40、规则的。如按极性减小的次序排列，次序越在后面的物质，极性越差，因而越易为非极性吸附剂所吸附而越难为极性吸附剂所吸附。3， 溶液 pH 值的影响pH 值影响某些化合物的离解度。4，温度的影响吸附热越大，则温度对吸附的影响越大。5，其它组分的影响当从含有两种以上组分的溶液中吸附时，根据溶质的性质可以互相促进，干扰或互不干扰。一般说来，对混合物的吸附较纯物质的吸附为差。第五节 离子交换法离子交换作用：是指一个溶液中的某一种离子与一个固体中的另一种具有相同电荷的离子互相调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下来。这里溶液称流动相，而固体称固定相。在发酵工业中可用于分离纯化蛋白质、氨基

41、酸、核酸、酶、抗生素等物质。一、基本原理离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，它的分子中含有可解离的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正方向进行，所以可以把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来，同时溶液中的离子全部被交换并吸附在树脂上。如果有两种以上的成分被交换吸着在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，其被洗脱的能力则决定于各自洗脱反应的平衡常数。离子交换过程有两个阶段吸附和解吸附。吸附在离子交换剂上的物质可以通过改变 pH 使吸附的物质失去电荷而达到解离但更多的是通过增加离子强度，使加入的

42、离子与被吸附物质竞争离子交换剂上的电荷位置，使被吸附物质与离子交换剂解开。不同物质与离子交换剂之间形成电键数目不同，即亲和力大小有差异 ，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。二、离子交换剂的分类1，阳离子交换剂：磺酸(-SO 3H)、磷酸(-PO 3H2)、 羧酸（-COOH）和酚羟基（-OH） 。可分为：强酸型、中酸型和弱酸型。2，阴离子交换剂：伯胺、(-NH 2)、仲胺(-NHCH 3)、叔胺N-（CH 3） 2和季胺-N（CH 3）2。可分为：强碱性、中碱性和弱碱性3，两性离子交换剂4，选择性离子交换剂5，吸附树脂6，电子交换树脂三、影响离子交

43、换速度的因素1，树脂颗粒的大小；2，树脂的交联度；3，溶液中离子浓度；4，温度；5，离子的大小；6，离子价；7，树脂强弱。四、离子交换的操作方式1，分批法2，固定床法3，流动床法第六节 膜分离过程1748 年法国学者 Abbe Nollet 首次提出了膜分离现象，经过近二个世纪的摸索、研究，20 世纪 50 年代膜分离技术才逐渐发展成为一门新兴高技术边缘学科。1963年第一个膜渗析器的诞生开创了膜分离技术的新纪元，二、三十年来得到了迅猛的发展，在各个工业领域及科研中得到大规模应用，出现了各种有价值的微滤、超滤、纳滤和反渗透等分离膜 。 膜分离技术的优点1，适用范围广； 2，膜分离过程为物理过程

44、，不需加入化学药剂； 3，膜分离技术分离装置简单，占地面 积小，系统集成容易 ；4，膜分离过程系统简单、操作容易，且易控制，便于维修，有利于生产自动化的推广与普及。一、膜分离方法的分类1，分类根据膜材质和方法的差异，可将膜分离方法分为以下种类：（1）透析（2）超滤（3）反渗透（4）微滤（5）电渗析（6）液膜技术（7）气体渗透（8）渗透蒸发2，膜过滤的孔径范围二、表征膜性能的参数1，孔的性质(包括孔径、孔分布和孔隙度)；2，水通量；3，截留率的截断分子量；4，抗压能力；5，pH 适用范围；6，对热和溶剂的稳定性。三、膜分离设备1，选择膜分离设备应考虑以下因素：（1）分离类型；（2）生产量；（3）

45、操作时的应变性；（4）保养难易程度；（5）操作方便与否。2，常用的膜分离设备（1）管式过滤器（内压式和外压式 ）（2）中空式过滤器中空纤维膜组件 用粗的中空纤维膜组装成用于超过滤的膜组件，它具有类似于单管程管壳式换热器的结构。所用的中空纤维，在内壁或内、外壁形成表层。内压式膜组件适合于管内流过料液，管间汇集渗滤波，外压式膜组件相反，管间走料液，管内汇集渗滤液。（3）螺旋卷式过滤器卷式膜组件是用平面膜卷制而成的。将两张超过滤膜叠在一起，表层各自向外，在三条边上相互粘合，形成一长信封式的膜袋，在此袋内插入一张挠性的多孔薄板。用一管壁钻有许多小孔、两端带有连接件的管子，作为膜组件的中心管。先将伸出膜

46、袋口外的多孔薄板卷绕中心管一圈，再将膜袋开口粘合。然后将一隔网叠在膜袋上，一起卷绕在中心管上，形成螺旋卷，最后将外缘封固。（4）平板式过滤器板式膜组件用平面膜组成。用它所组装的超过滤器在结构上与压滤机相近，而差别有二：其一是压滤机有料液进口和滤液出口，须拆卸机体才能取出滤饼；而超过滤器内不生成滤饼，设备不需经常拆卸，除了料液进口、渗滤液出口外，还须有滤余液出口。其二是超过滤器须迫使料液作高速流动以减轻浓度极化的影响，而压滤机无此要求。因之，在设备内超过滤用串联流道，压滤用并联流道。各种膜分离设备性能的比较各种膜分离设备性能的比较形 式 优 点 缺 点管式 易清洗，无死角适宜于处理固体较多的料液

47、，单根管子可以调换保留体积大，单位体积中所含过滤面积较小，压力降大中空纤维 保留体积小，单位体积中所含过滤面积大，可以逆洗，操作压力较低（0.25Mpa） ，动力消耗较低料液需要预处理，单根纤维损坏时，需调换整个模件螺旋卷式膜 单位体积中所含过滤面积大，换新膜容易料液需要预处理，压力降大，易污染，清洗困难平板式 保留体积小，能量消耗界于管式和螺旋卷式之间死体积较大四、操作特性1，浓差极化：当溶剂透过膜，而溶质留在膜上，因而便膜面浓度增大，并高于主体中浓度这种浓度差导致溶质自膜面反扩散至主体中，这种现象称为浓差极化。2，凝胶层：当膜面浓度增大时，通量降低。当膜面浓度增大到某一值时，溶质成最紧密排

48、列，或析出形成凝胶层。 浓差极化示意图 凝胶层的形成为了减少浓差极化的发生，膜过滤一般采用的错流过滤方式。错流过滤是一种新的过滤方式与常规过滤的区别在于它的固体悬浮液流动方向与过滤介质平行，而常规过滤则是垂直的，因此，能连续清除过滤介质表面的滞留物，使滤饼不能形成，所以整个过滤中能保持较高的滤速。 五、膜分离过程在发酵工业中的应用微滤（MF）膜、超滤（ UF）膜、纳滤（NF）膜、反渗透（RO ）膜六、影响超滤速度的各种因素1，压力当压力较低时，通量较小，膜面上尚未形成浓差极化层，此时通量随压差成正比增大。当压力逐渐增大时，膜面上开始形成浓差极化层，通量随压差而增大的速度开始减慢。当压力继续增大

49、时，浓差极化层浓度达到凝胶层浓度时，通量不随压差而改变。因为当压力继续增大时，虽暂时可使通量增加，但凝胶层厚度也随之增大，即阻力增大，而使通量回复至原值。2，发酵液浓度、温度、流速通量与料液流速成正比；通量与操作温度成正比；通量与固体浓度成反比。如下图所示。3，膜的污染膜在使用中，尽管操作条件保持不变，但通量仍逐渐降低的现象称为污染。污染的原因一般认为是膜与料液中某一溶质的相互作用，或吸附在膜上的溶质和其它溶质的相互作用而引起的。 膜污染与浓差极化的区别：浓差极化是可逆的，即变更操作条件可以使浓差极化消除，而污染则必须通过清洗的办法，才能消除。经清洗后如纯水通昼达到或接近原来水平，则认为污染已消除。减轻膜污染的方法预处理将料液经过一预过滤，以除去较大的粒子，特别对中空纤维和螺旋卷绕式超滤器尤为重要。蛋白质吸附在膜表面上常是形成污染的原因，调节料液的 pH 远离等电点可使吸附作用减弱。但如吸附是由于静电引力，则应调节至等电点。盐类对污染也有很大影响，pH 高，盐类易沉淀，pH 低盐类沉积较少。加入络合剂如 E DTA 等可防止钙离子等沉淀。改变膜的表面性质制膜时，改变膜的表面极性和电荷，常可减轻污染。例如 Amicon