1、实验 超氧化物歧化酶的分离、纯化超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe 的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(0 2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于 SOD 能专一消除超氧阴离子(O 2-)而起到保护细胞的作用，SOD 作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。按金属辅基成分的不同可分成 3 种类型。
2、最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为 3.2104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由 2 个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基( 肽链) 含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由 4 条或 2 条肽链组成。第三种是 Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe
3、-SOD 纯品呈黄色或黄褐色，由 2 条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个 Fe 原子。实验（一） 超氧化物歧化酶的活性测定原理SOD 的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和 O2-，利用 SOD 分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte 还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定 Mn-SOD，但对于 Cu/Zn-SOD 反应极灵敏。Cy
4、te 还原法用于 Mn-SOD 活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。亚硝酸盐形成法与 CN抑制剂或 SDS 处理相结合，应用于 Mn-SOD 测定，灵敏度比 Cyte 还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。在一般情况下，SOD 酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 O2-，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
5、这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留 3045s 后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在 4min 的范围内，中间物在 420nm波长出有强烈光吸收。当有 SOD 存在时，由于它能催化 O2-与 H+结合生成 O2 和 H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出 SOD 的酶活性。酶活力单位定义：在 25恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达 50%的酶量定义为 1 个酶活力单位。试剂和器材1、试剂（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl称取 Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至 80mL
6、左右，用 HCl 调节 pH =8.20（用 pH 计校正） ，最后定容至 100mL。（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L 邻苯三酚称取邻苯三酚 0.063g，用 10mmol/L HCl 溶液溶解，定容至 10mL，避光保存。（4）SOD 样液2、器材（1）恒温水浴槽（2）紫外分光光度计（3）试管、刻度吸管、微量注射器方法和步骤1、邻苯三酚自氧化速率的测定取两支试管按下表加入 25预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl 代替邻苯三酚 ） ，迅速摇匀，立即倾入 1cm 比色杯中，在 325nm 波长处测定光吸收值，每隔 30s 读数一次，
7、测定 4min 内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为 0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值） 。试剂 空白管（mL） 自氧化管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl 2.98 2.9810mmol/L HCl 0.02 0.0150 mmol/L 邻苯三酚 - 0.012、SOD 样液的活性测定样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。试剂 空白管（mL） 样品管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl 2.98 2.9810mmol/L HCl 0.02 -SOD 样
8、液 - 0.0150 mmol/L 邻苯三酚 - 0.01（3）计算样 液 体 积样 液 稀 释 倍 数反 应 液 总 体 积样 液 速 率）酶 活 性 （ %5017./mLU实验（二） 动物血中超氧化物歧化酶的提取原理l969 年，McCord 和 Fridovich 第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。 自然界中SOD 分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其 SOD 的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到 SOD。为拓宽提取 SOD 的原料，筛选或基因过程开发产 S
9、OD 量较高的菌株。目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯 SOD。从动物血液材料中制备 CuZn-SOD 纯化工艺分为三个主要步骤：（1）原材料的预处理；（2）粗酶液的制备；（3）离子交换柱层析精制。国内多采用 Mccord 和 Fridovich 法，其主要工艺过程为：第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换柱层析精制。试剂和器材1、 试剂（1）3.8%（质量分数）柠檬酸三钠（2）0.9%（质量分数）氯化钠（3）95%（体积分数）乙醇（4）氯仿（5）丙酮（6）pH7.6、2.5mmol/L K 2HPO4-KH2PO4 缓冲液（
10、7）DEAE-Sephadex A-502、 器材（1）猪血（2）恒温水浴（3）离心机（4）布氏漏斗、抽滤瓶（5）烧杯、量筒、搅棒（6）透析袋方法和步骤1、从猪血中提取 SOD（1）分离血球取新鲜猪血，加入到 3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为 3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min 离心 20min，收集红血球。（2）除血红蛋白红血球用 3 倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min 离心 20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入 11.1 倍体积去离子水，搅拌溶血 30min，再向溶血液中分别缓慢加入 0.25 倍体积的预冷 95%乙醇和 0.15 倍体积的预冷氯仿
11、，剧烈搅拌 15min 左右，静置 1h，然后 4 000r/min 离心 20min 除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。（3）热变性上清液加热到 65，保温 10min，然后迅速冷却到室温， 3 000r/min 离心 20min，弃去沉淀物，收集上清液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。（4）沉淀清液在盐冰浴中冷却，然后在-5以下的操作温度下，加入 1.5 倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置 23min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，4 000r/min 离心 20min，除去不溶物，用 pH7.6 的 2
12、.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4 缓冲液透析，即得粗 SOD 溶液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。结果与计算1、计算每步操作所得酶液的酶活性、蛋白浓度和比活力。2、计算每步操作的酶活性回收率、蛋白回收率和纯化倍数。实验（三）离子交换层析纯化超氧化物歧化酶原理本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质，在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白，进而除去杂蛋白。实验中选用 DE-32 离子交换纤维素。相关原理请参见实验教材中离子交换层析一章。试剂和器材1、试剂（1）DE-32（2）缓冲液：2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6 ）（2）缓冲液：
13、200mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6 ）2、器材（1）层析柱(2.5cm 25cm)（2）部分收集器（3）梯度洗脱仪（4）紫外分光光度计（5）试管、透析袋方法和步骤1、DEAE- 纤维素的预处理：（1）称取 5gDE-32，撒在盛有 75mL 0.5mol/L HCl 的烧杯中，室温放置 30min，不时轻轻搅拌。（2）将糊状物移入 3 号砂芯漏斗中，用蒸馏水淋洗。如此重复，每加一次去离子水，浸泡一段时间，再进行抽滤，至洗涤液 pH 等于 4 即可（pH 试纸试） 。（3）将糊状物移入烧杯中，加入 75mL 0.5mol/L NaOH，放置 30min，不时轻轻搅拌，弃去
14、上清液，依同法用 0.5mol/L NaOH 再处理一次。（4）将交换剂移入 3 号砂芯漏斗中，反复用去离子水淋洗，直至洗涤液 pH 为8.0（可用 pH 试纸测试） 。（5）将 DEAE-纤维素浸泡在 150mL 去离子水中。用 0.5mol/L 盐酸把 pH 调至 7.6，滴定可在 pH 计上进行，须使悬液最终 pH 在 10min 内无变化，然后抽滤。（6）将上述滤块置于 100 毫升量筒中，加入 75mL 缓冲液 I，慢慢搅混之后，静置20min，用倾斜法除去上清液中细微粒子，如此重复若干次，最后上清液 pH 与缓冲液 I 几乎一致。2、装柱（1）层析柱用洗涤液洗清洁，柱的下端联接塑料
15、管，装上螺旋夹。关上螺旋夹，柱内装入缓冲液 I，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，赶走死区及塑料管中的气泡，柱中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。（2）将基本平衡好的 DEAE-纤维素浆液（约有 1 倍体积的缓冲液 I）放在抽滤瓶中减压除尽气泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高约 1cm 高度时，部分旋松螺旋夹，让溶液缓慢流出去，注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢，陆续加入较多的浆液，直至达到高 10cm 以上的柱床体积。3、平衡当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始缓冲液进行平衡。流速可维持在 4mL/15min，直至流出液的 pH 与上柱缓冲液完全相同。 （一般要平衡 8h 以上或过夜。 ）4、层析用
16、毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分液体，打开出口使缓冲液恰流到表面，关闭出口。用毛细吸管小心地沿柱壁四周缓缓加入 SOD 粗酶液，打开出口，使样品溶液进入纤维素内，至几乎露出床面时，柱壁用少量缓冲液小心洗涤 23 次，然后装入缓冲液，使液面高出创面23 cm 左右。5、洗脱（1）按图将梯度洗脱器和层析柱连接好。（2）在洗脱瓶 A（贮存器）和洗脱瓶 B（混合器）内各装入 100mL 缓冲液和缓冲液，注意两洗脱瓶，特别是液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内气泡。（3）开动电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。（4）将两瓶和柱上下连接管道打开，开始收集洗脱流出液，控制
17、流速在1.5mLmin。 收集液测定蛋白质浓度和酶活性。（5）收集合并具有 SOD 活性部分的洗脱液，透析浓缩后冷冻干燥即得纯化 SOD（淡蓝绿色产品） 。结果与计算1、画出层析图谱并标出酶活曲线和线性梯度曲线。2、计算蛋白回收率、酶活回收率、纯化倍数。3、求出酶活最高峰时洗脱液盐的浓度。实验（四）金属螯合层析分离纯化超氧化物歧化酶原理金属螯合层析是利用固定相偶联的配基亚氨基二乙酸(IDA)及金属离子发生螯合作用，该金属离子又与蛋白分子中的某些含有巯基或咪唑基的氨基酸结合。金属螯合层析主要分为 3 个阶段：第一阶段是螯合介质与二价金属离子作用生成金属螯合介质；第二阶段是在一定的条件下金属螯合介
18、质与被分离蛋白质分子形成金属螯合复A B图 梯度洗脱装置示意图合物；第三阶段是从金属螯合介质上将被分离物质解吸下来。本实验采用亚氨基二乙酸(IDA)以二纳盐形式与环氧化的琼脂糖-6B 结合，再在偏碱性的条件下与二价金属铜离子发生可逆性螯合，二价金属铜离子又与含有咪唑基的超氧化物歧化酶发生可逆性的螯合吸附。金属离子在螯合介质与被分离分子之间起着桥梁作用，金属离子的一端与螯合介质连接，另一端与被分离组分结合。这两种结合方式都是可逆的，在一定条件下洗脱被分离组分。试剂和器材1、试剂（1）琼脂糖（2）亚氨基二乙酸（IDA）（3）环氧氯丙烷（4）三羟甲基氨基甲烷（Tris）（5）氢氧化钠（6）氯化钠（7
19、）硼氢化钠（8）pH10.0、2mol/LNa 2CO3 -NaHCO3 缓冲液（9）pH7.2、20mmol/L 磷酸缓冲液2、器材（1）层析柱（2）紫外分光光度计（3）部分收集器（4）沸水浴（5）金属网筛方法和步骤1、IDA-琼脂糖 6B 的制备称取琼脂糖 2g，加入蒸馏水 30mL，沸水浴充分溶解，待冷却结块后，过 2030 目筛，称重，每克湿重加入 1mol/L NaOH（含 0.2%NaBH4）1mL，然后在 30水浴中搅拌下加入1/10 倍上述氢氧化钠体积的环氧氯丙烷。水浴温度缓慢升至 60，保温继续反应 2h，趁热过滤并用预热的蒸馏水洗涤至近中性。10g 上述凝胶中加入 50mL
20、 含 2g IDA 的 pH10.0、2mol/LNa 2CO3-NaHCO3 缓冲液，于6065水浴中搅拌 24h，其间分次加入 20 mL 含 3g IDA 的碳酸盐缓冲液。反应产物用 2L水、10% 乙酸 0.5L、2L 水依次洗涤。2、柱制备按常规将 IDA-琼脂糖 6B 装柱（1.5cm20cm ） ，用 10mmol/LCuSO4 流过层析柱，螯合铜离子，制备成亲和层析柱。3、SOD 亲和层析亲和层析柱用 20mmol/L 磷酸缓冲液（ pH7.2，含 0.5mol/LNaCl）平衡，含 SOD 的粗制品上柱后，依次用 20mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.2 ，含 0.5mol/LNaCl） 、20mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0，含 0.8mol/LNaCl） 、20mmol/L 磷酸缓冲液pH7.8，含 0.5mol/L(NH4)2SO4洗脱。收集 SOD 活性峰，测定酶活性和蛋白质浓度。结果与计算计算金属螯合层析前后样品和收集峰的酶比活、纯化倍数、酶活性回收率和蛋白质回收率。
