1、卵巢上皮性癌组织中p15、p16 基因突变及其临床意义中华妇产科杂志 2000 年第 7期第 35卷 论著摘要作者：李红霞 江森 李文军单位：李红霞（现在北京铁路总医院妇产科） ；江森（250021 济南，山东医科大学附属医院妇产科） ；李文军（重庆第三军医大学妇产科）p15、p16 基因是近年来发现和分离的两个抑癌基因。研究表明，p15、p16 基因突变与人类肿瘤的发生有关，在多种原发性肿瘤及其肿瘤细胞系中均存在 p15、p16 基因纯合性缺失与点突变1 。本研究旨在通过检测卵巢上皮性癌（OEC）中p15、p16 基因纯合性缺失与点突变，探讨其在 OEC发生、发展中的作用，并评价其可否作为肿
2、瘤标记物应用于 OEC的诊断、监测及预后的判断。一、资料与方法1.研究对象：43 例 OEC、11 例卵巢良性上皮性瘤及 4例卵巢交界性上皮性瘤取自山东医科大学附属医院、山东省立医院及解放军第九医院妇产科 19951997 年住院的手术患者。OEC患者平均年龄 53岁（2974 岁） ；病理类型包括，浆液性囊腺癌 23例、粘液性囊腺癌 12例、未分类癌 6例及子宫内膜样癌 2例；按国际妇产科联盟 1988年手术病理分期，早期（期）12 例、晚期（期）31 例；按世界卫生组织标准，病理分级为 G1G2 级 32例、G3 级 11例；同时伴有腹膜、邻近器官或淋巴结等转移者 29例。患者均为初次手术
3、，术前均未予化学治疗（化疗）和放射治疗（放疗） 。卵巢良性上皮性瘤患者平均年龄 46 岁（2972 岁） ，其中浆液性囊腺瘤 6例，粘液性囊腺瘤 5例。卵巢交界性上皮瘤患者平均年龄 34岁（2159 岁） ，其中浆液性及粘液性肿瘤各 2例。2.方法：（1）标本制备及 DNA提取：取患者肿瘤及瘤旁组织（有转移者同时取转移灶组织）共 145份，以组织包埋剂包埋，立即置于液氮中速冻，然后转移至-80冰箱中保存。使用时先制成 5 m 厚的冰冻切片，行显微分离肿瘤组织，对照苏木素伊红染色，于光学显微镜下观察，选择肿瘤细胞富集区（肿瘤细胞与间质细胞比例70%） ，以手术刀片分离、刮取肿瘤细胞并提取 DNA
4、。 （2）p15、p16 基因纯合性缺失和点突变的检测及判断标准2：采用多聚酶链反应及琼脂糖凝胶电泳方法检测 p15、p16 基因纯合性缺失，以多聚酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测 p15、p16 基因点突变。判断标准：p15、p16 基因纯合性缺失的标准为肿瘤组织 p15（或 16）与正常组织 p15（或 16）的比值0.25 ；PCR-SSCP 分析 p15、p16基因点突变， 则是与自体正常组织对比,肿瘤组织出现异常迁移带者表示有基因点突变。3.统计学处理：采用 SAS软件作 2 检验（四格表确切概率法）及相关分析。二、结果1. 卵巢良性、交界性上皮性肿瘤及 OEC癌旁
5、组织中p15、p16 基因纯合性缺失和点突变的检测：卵巢良性、交界性上皮性肿瘤及 OEC癌旁组织中未检测到 p15、p16 基因纯合性缺失和点突变，OEC 组织中 p15基因纯合性缺失率为46.5%（20/43） ，与良性肿瘤比较，差异有显著性（P0.01） 。OEC组织中 p15基因纯合性缺失包括 E1、E2 共同缺失 4例，占缺失总数的 20.0%;仅 E1缺失 10例;仅 E2缺失者 6例。PCR-SSCP检测未发现 p15基因点突变。OEC 组织中 p16基因纯合性缺失率及点突变率分别为 16.0%（7/43）及 7.0%（3/43） ，其中E1缺失者 5例，E1、E2、E3 完全缺失
6、者 1例，E2、E3 共同缺失者 1例。p16 基因发生点突变的 3例均位于 E2，且表现为杂合性。p16 基因的纯合性缺失及点突变率，OEC 组织与良性、交界性肿瘤组织比较，差异均无显著性(P0.05)。OEC 组织中p15、p16 基因总变异率（包括纯合性缺失率及点突变率）为70.0%。在 p16基因突变（包括纯合性缺失与点突变）的 10例中，9 例同时存在 p15基因的纯合性缺失；而在 p16基因正常的 33例中，仅有 1例有 p15基因的纯合性缺失，两者比较，差异有显著性（P0.01） 。p15、p16 基因突变之间存在正相关性（r=0.48） 。2. p15、p16 基因突变与临床病
7、理：病理分级 G3级中 p15基因的纯合性缺失率为 63.6%，较 G1、G2 级的 40.0%有升高趋势，但两者比较,差异无显著性(P0.05)。p15、p16 基因变异多发生于浆液性囊腺癌，与其他类型 OEC比较，差异也无显著性(P0.05)。见表 1。肿瘤转移灶组织中 p15、 p16基因纯合性缺失率分别为 64.0%及 38.5%,与原发灶比较，差异无显著性(P0.05)。表 1 p15、p16 基因突变与临床病理参数的关系类别总例数 p15 基因缺失 P值 p16基因突变 P值例数 百分率（%）例数 百分率（%）手术病理分期 早期 12 5 41.7 216.6 晚期 31 15 4
8、8.40.058 18.6 0.05 病理分级 G1G2 级 32 1340.6 7 21.9 G3 级 11 7 63.60.053 27.3 0.05 淋巴结转移 有 29 1241.3 7 24.1 无 14 857.10.053 21.40.05 病理类型 浆液性囊腺癌 23 13 56.5 6 26.0 粘液性囊腺癌 123 25.0 3 25.0 未分类癌 6 4 4/6* 1 1/6* 子宫内膜样癌 2 0 0/2*0.050 0/2*0.05 *例数少于 10，不计百分率 三、讨论1.p15、p16 基因突变与 OEC形成和发展的关系：本研究结果显示，OEC 组织中 p15、p
9、16 基因总突变率高达 70.0%，且p15、p16 基因突变之间存在正相关，提示，p15、p16 基因突变是 OEC形成中的一个普遍现象，两者共同参与了 OEC发生、发展。本研究发现，p15 基因变异的形式为纯合性缺失而非点突变，表明纯合性缺失为该基因失活的主要方式，与其他作者的报道一致3 。值得注意的是，本组资料中的 3例 p16基因点突变均为杂合性，其他作者亦有类似报道，提示，p16 的 1个等位基因是因突变而失活，而另外 1个等位基因失活可能是由于其他机理，如甲基化作用、杂合性缺失；或如 p53基因一样，p16亦为显性基因，其中 1个等位基因突变，即引起细胞周期正常演进的紊乱4 ，其确
10、切机理尚有待于进一步的探讨。2.p15、p16 基因突变的临床意义：本研究结果显示，在卵巢良性及交界性上皮性肿瘤中未检测到 p15、p16 基因纯合性缺失和点突变，提示，p15、p16 基因变异是恶性肿瘤的特征性改变，有望作为肿瘤标记物用于 OEC的诊断及与良性肿瘤的鉴别诊断中。因 p15、p16 基因突变率在患者各预后影响因素如临床分期、病理分级以及有无肿瘤转移等之间的差异无显著性，故其价值尚有待于进一步探讨。参考文献1，Fujita M, Enomoto T, Haba T, et al. Alteration of p16 gene and p15 genes in human epih
11、telial ovarian tumors. Int J Cancer,1997, 74:148-155.2，Wong YF, Chung TK, Cheung TH, et al. P16INK4A and p15INK4B alterations in primary gynecologic malignancy. Gynecol Oncol，1997, 65:319-324.3，Roesler JM, Livignston EH, Strivatsan E, et al. Deletion of p15(MTS2) in head ang neck squamous cell carcinomas. J Surg Res, 1998, 77:50-54.4，Pinyol M, Francese C, Bea S, et al. P16INK4A gene inactivation by deletions, mutations, and hypermethylation is associated with transformed and aggressive variants of non-Hodgkins lymphomas. Blood, 1998, 91:2977-2984.
