1、酶联免疫斑点及其标准化 Enzyme Linked ImmunoSPOT,达科为生物技术有限公司 朱义鑫 2005.9.16,Elispot实验结果（透明板）U-Cytech 公司 Elispot实验结果（PVDF板）U-Cytech 公司,ELISPOT技术起源与发展 细胞与细胞因子 ELISPOT技术原理 ELISPOT 和 ELISA的区别 ELISPOT的优点,第一部分：前言,1983年, Czerkinsky 同年业发展出双色标记技术； 1993年，Shaw et.al.: 首次将PVDF膜板引入ELISPOT 1997年，Gui et.al.：发展出计算机辅助的斑点技术技术。,1.
2、ELISPOT技术起源与发展,T细胞在免疫系统中起着关键性的作用，尤其是起免疫调节作用的辅助细胞Th。它们参与了细胞免疫(Th1)和体液免疫(Th2) 抗原或者有丝分裂原刺激T细胞、单核/巨噬细胞分泌细胞因子Th1 cells IFN-,IL-2Th2 cells IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13Tc cells IFN-, TNF-, 颗粒酶B，穿孔素单核/巨噬细胞 TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-10, IL-12 细胞因子的分泌以及对效应细胞的调节构成了一个精确的免疫系统调节网络。,2.细胞与细胞因子,用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞
3、因子，并以斑点显色的方式将其表现出来。,3.ELISPOT技术原理,4.ELISPOT 和 ELISA的区别,ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展。两者都可检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同:,ELISA测定的是蛋白浓度，ELISPOT测定的是细胞频率；（整体水平与单细胞水平） ELISA是免疫检测Immuno-Assay，而ELISPOT是生物检测Bio-Assay（活细胞，功能检测） ELISA检测的特异性表现在抗体上，ELISPOT检测的特异性及表现在双重的刺激源和抗体上。,5.ELISPOT的优点
4、,目前，检测细胞因子或者细胞免疫反应的方法有以下几种：ELISA、ELISPOT、FACS、Tetramer、3H胸苷参入法、51Cr释放法。 高灵敏：度少至1001,000个分子/Cell即能够被检测。比ELISA的灵敏度高200倍。单细胞水平：即使只有一个阳性细胞也能够检测出来，比FACS灵敏。高通量：每个研究人员每天可作数百样本的检测。High Throughput Screening,在106抗原呈递细胞（APC）中混入已知数量的IFN-阳性T淋巴细胞，然后用三种方法分别进行检测。,X坐标：各检测方法的检测结果 Y坐标：每百万APC中实际IFN-+T细胞数量,ELISPOT/FACS/
5、ELISA 检测精确度比较,ELISPOT 流式荧光染色 ELISA,第二部分：技术特点,技术操作流程 ELISPOT技术要点 塑料板与膜板 膜结构与抗体包被 细胞处理 有血清与无血清 刺激物选择 建立阳性对照 调整适当的细胞浓度 预培养法与直接法 各种染色系统,包被抗体 4 过夜，洗涤； 封闭37 1h； 加入淋巴细胞和刺激原37 孵育8-40h； 冰水裂解并移出细胞，洗涤； 加入生物素标记的检测抗体37 1h，洗涤； 加入酶联亲和素37 1h，洗涤； 加入显色底物，显色1040min； 获得斑点，计数。,1，2,3,4,5,6,7,8,1. ELISPOT一般操作流程,2. ELISPOT
6、技术要点,细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染 细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开关CO2孵箱 洗涤要充分，尤其是裂解细胞之后的洗涤 洗涤时，枪头不能接触到膜，从孔中移出液体采用倾倒的方式 洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干,塑料板：U-cytech公司特有的透明版 操作简单，方便，省时，价廉，适于初学者以及科学研究。 膜板：PVDF膜板、NC膜板 操作复杂，但是斑点漂亮，适合有经验的实验者。,3.塑料板与膜板,塑料板：U-cytech公司特有的透明版,优点： 透明全塑料板，易于操作，可以随时观察细胞； 可以快速包被，节省实验时间； 可回收细胞和上清； 价格只有PVDF膜板的一
7、半。 缺点： 吸附能力比膜差，斑点松散，易受粒细胞的分解； 裸视下斑点为灰白色，不如有颜色斑点明显； 只有一种染色系统，不能用于多色分析。,修饰的HRP/银染系统,膜板：PVDF膜， NC膜,优点： PVDF膜的吸附能力更强，斑点致密、圆润； 斑点颜色鲜艳，易于判读； 能用于多色ELISPOT实验。 缺点： 需酒精预湿等步骤，操作稍复杂； 因为膜的渗漏问题，在洗涤步骤稍复杂； 几乎不可能回收细胞和上清； 膜的脆弱性，实验中的操作与保存更困难。,HRP/DAB,AP/BCIP&NBT,HRP/AEC,IFN-,IL-5,IL-10,IFN-,PMA/ionomycin 2.5x104 hu-PB
8、MC indirect,tetanus 105 hu-PBMC indirect,ConA 2.5x104 hu-PBMC indirect,ICE Peptide Pool 2x105 hu-PBMC indirect,IL-5,IL-12p70,IFN-,PMA/ ionomycin 2x105 hu-PBMC indirect,LPS/ IFN- 2.5x104 hu-PBMC direct,ICE Peptide Pool 2x105 hu-PBMC indirect,PVDF板、透明板的典型斑点图像,4. 膜结构和抗体包被,通常的包被条件是4过夜，也可以室温2小时 37 包被不能超过
9、1小时，否则包被效率急剧降低 膜吸附能力远远超过包被抗体的量，所以需要封闭 包被后必须接着封闭，否则包被抗体会逐渐失活 封闭之后用纯水或PBS洗涤，可以在4长期存储,关于膜的一些参数（单孔面积） 厚度：120-150um 最大蛋白吸附量： 80-100 ug ELISPOT所需量：1 ug 包被抗体集中于膜表面1um (透明板容纳量为：30-40 ug),从外周血提取淋巴细胞时, 应避免凝血引起的细胞活性降低；血液越新鲜越好，全血不应该存放超过6小时。 只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞、粒细胞和杂质的干扰 从小鼠的脾脏取淋巴细胞时，尤其要注意，加入ELISPOT培养孔
10、的细胞须为单细胞悬液 预培养的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液变黄）会影响斑点的形成 预培养后的细胞入ELISPOT培养板前应更换培养液,ELISPOT实验的难点在于细胞处理与培养,5. 细胞处理,6. 有血清与无血清,血清是细胞培养所必需的添加品 ，ELISPOT有细胞培养的过程，所以需要血清 但是血清批次间差异大、成分未可知，为ELISPOT增加了严重的不确定性因素。有些批次的血清严重干扰试验结果。 无血清培养法已经成熟，其优点： 成分固定，彻底消除了批次间的差异，结果可以在全世界的试验室之间比较。 不含杂蛋白，背景更弱，斑点更清晰。 不含抑制细胞因子分泌成分，斑点更多，更加反映真实的结果。
11、 目前只能用于直接法，间接法孵育时间过长，细胞生长受影响，结果不理想。,119 SFC,267 SFC,我们自己的试验结果：PHA/10,000 Hu-PBMC 上：5%小牛血清（杭州）下：无血清培养基U-cytech),非特异性刺激物 有丝分裂原 ConA，PMA，PHA，Ionomycin 特异性刺激物 重组蛋白 病毒载体或者病毒颗粒 重叠肽段 表位肽注意： 直接在ELISPOT培养可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少。此时可以采用预培养法。 部分多价抗原刺激物导致细胞凋亡，可以换用单价抗原刺激物。 核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性较弱，应该加强刺激浓度、辅助刺激物、延长刺激时间等。,
12、7. 刺激物选择,8.建立阳性对照,非特异性刺激阳性对照： ConA 伴刀豆蛋白A 0.4-1.0ug/well PHA 植物血球凝集素 0.3-1.0ug/well Ionomycin 伊诺霉素 50-100ng/well PMA 14烷酰佛波乙酯 5.0-10ng/well特异性阳性刺激原：国际标准多肽池CEF CMV， EBV， influenza virus,在PBMC的IFN- ELISPOT 分析中： 自发斑点频率：1050/百万PBMC细胞；(十万分之一） PHA刺激频率：104105/百万PBMC细胞；（百分之一） CEF刺激频率：500 5000 /百万PBMC细胞（千分之一
13、）,阳性对照实例,未 刺 激 40SFC/百万PBMC,CEF 刺 激 3，400SFC/百万PBMC,PHA 刺 激 26，000SFC/百万PBMC,人PBMC40万/孔 U-cytech无血清培养基,人PBMC1万/孔 U-cytech无血清培养基,人PBMC5万/孔 U-cytech无血清培养基,4,265,177,9.调整适当的细胞浓度,1244 692 355 192,40万 20万 10万 5万,20-40万/孔形成最大密度的单层细胞 根据所使用刺激原作初步调整 ConA PHA PMA ：0.5-5万/孔 特异性刺激物：5-40万/孔 根据预实验的斑点数目作精细调整,人PBMC
14、/CEF刺激 U-cytech无血清培养基,10. 预培养法与直接法,预培养法即：预先将细胞和刺激物加入24孔板中作预孵育和刺激，然后再加入ELISPOT板进行实验。 大多数ELISPOT实验都可以用直接ELISPOT法得到可接受的结果。 预孵育的优点： 经过预孵育，斑点更分散，清晰 可以除去贴壁的巨噬细胞，从而减少小斑点的影响；粒细胞的影响（虫啃）也可以大大减轻 某些细胞因子通常很难用直接法得到结果，比如颗粒酶、IL-10 预孵育的缺点： 需要长时间孵育刺激，更为严格的无菌操作环境 需耗费额外的物资和时间,直接法PVDF 刺激物：ICE Peptide Pool 40 Hours,2 X 1
15、05 Cell/ Well,预孵育法PVDF 刺激物：ICE Peptide Pool 24+16 Hours,2 X 105 Cell/ Well,IFN-直接法与预培养法比较,直接法PVDF 刺激物：破伤风杆菌 40Hours, 2X105Cell/Well,预孵育法PVDF 刺激物：破伤风杆菌 24+16 Hours, 2X105Cell/Well,IL-10直接法与预培养法比较,11.各种染色系统,修饰的HRP/银染系统,HRP/AEC,AP/BCIP&NBT,HRP/DAB,透明板：只有一种修饰的HRP/银染系统，白色不透明斑点。 PVDF板：两种标记酶 辣根过氧化物酶HRP-显色快
16、，但是背景高(30min) AEC底物，颜色鲜艳，但易退色 DAB底物，棕色斑点，着色稍牢固，但是板点松散 碱性磷酸酶AP-显色慢，但是背景干净(2h) BCIP&NBT混合底物，蓝黑色，着色牢固,第三部分：ELISPOT标准化,标准化的概念 标准化的实验室管理 标准化的实验操作(SOP) 标准化的质控参比,标准化的概念,ELISPOT标准化是一套完整的系统： 标准化的实验室管理 美国建立了Good Laboratory Practices GLP规范 标准化的实验操作 达科为提供ELISPOT标准化的操作程序SOP 标准化的质控系统 质控细胞 质控阳性刺激物 人员培训 质控ELISPOT操作
17、 只有所有的实验室管理都遵循标准化这种规范，所有的实验操作都遵循标准化的这套标准，质控系统才能正常运作，ELISPOT标准化才能真正建立起来。,标准化的操作(SOP),仪器 耗材 试剂 人员 操作流程 采血 分离 冻存 复苏 ELISPOT程序 数据分析、处理,仪器,离心机 专业的细胞离心机，指示准确，转速平稳，不晃动，启动制动平稳，最好能控制温度。否则会损失细胞或者伤害细胞。 电动移液器 有较好的手感，能靠按压的力度的变化灵敏的调节流速。 单道枪和多道枪 度量准确，润滑良好，否则会增加污染的机会。,耗材与试剂,需要进口耗材 关键性的试剂必须使用进口产品 严格控制试剂的无菌状态，标注试剂的批次
18、、保质期，注意试剂的保存温度和状态。 注意耗材和试剂的使用温度：室温，4度，-20度,人员培训,人员培训是标准化最重要的环节 购买达科为公司ELISPOT读板仪或者是即可的客户，可以得到我公司免费的人员培训，手把手的教会客户建立ELISPOT标准化的整套系统,标准化的操作流程,标准化的操作流程从试验样品的采集阶段就开始了，一直延续到实验数据处理的最后阶段。 血液样品的采集、运输和短暂存储； 淋巴细胞分离，保证较高的得率和纯度，最大限度的减少对ELISPOT有明显干扰的红细胞和粒细胞的影响 PBMC的冻存与复苏，这是ELISPOT标准化中最困难与核心的部分，我们可以保证细胞90%的存活率，并且保证复苏之后的细胞与新鲜细胞有相同的SFC频率。 标准化的ELISPOT程序，无血清技术，最大限度的减少各种不确定因素的干扰。,59 56 64,245 342 304,新鲜细胞 有血清冻存 无血清冻存,标准化的质控系统,达科为与中国生物制品检定所合作，正在建立中 冻存的质控细胞库 标准阳性刺激物 标准的操作方法 细胞复苏 ELISPOT程序 数据的分析、处理 结果有效性判定,合作单位,中国生物制品检定所 中国疾病预防控制中心 协和医院 感染科 第二军医大学 免疫学研究所 深圳市清华源兴生物医药有限公司,谢谢大家！,
