1、荧光素 FITC 标记抗体的方法当 FITC 在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的 r 氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成 FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个 IgG 分子中有 86 个赖氨酸残基，一般最多能结合 1520 个，一个 IgG 分子可结合 28个分子的 FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用 Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick 等标记法或 Clark 等(1963)的透析标记法。1Marsshall 法(1)
2、材料 抗体球蛋白溶液、05molL(pH90)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1硫柳汞水溶液、50ml 小烧杯、 4冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH72 或30 的 001molLPBS 等。(2)方法及步骤 抗体的准备 取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为 20mg ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的 110，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)510min。荧光素的准备 根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加 001mg 荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白
3、、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。a蛋白溶液：含量 Amgm1；容积 Bml。b总蛋白量 (AXB)Crag。cC20C10Dmg( 如蛋白含量低于 20mgml，用C10；如高于 20mgml，用 C20)。d荧光素 FITC 的量：(1502100)XCEmg 。e巳 05mol L(pH95)碳酸盐缓冲液 D10 Fml。f PBS 量 D-(B+F)=Gml。注：A 为蛋白含量，mgml；B 为蛋白质溶液的容积；C 为蛋白总量，mg；D 为常数，mg；正为荧光素的量， mg；F 为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G 为 PBS 的容积，ml。结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐
4、加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在 510min 内加完)，加完后，继续避光搅拌 12h 左右。结合期间应保持蛋白溶液于 4左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人 4冰箱中。透析 结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500rmin)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用 pH80 缓冲盐水透析(0 4C)过夜。过柱 取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶 SephadexG-25或 G50 柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：001molL 磷酸盐缓冲液(pH72)；过滤量：12ml 标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20ml( 稀释
5、 17 倍左右)。2Chadwick 法(1)试剂和材料 抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0 01mol/L pH8.0PBS、1% 硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。(2)方法及步骤 抗体准备 用 o4C 的 pH8。0 磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为 3040mg ml，置入 25ml 烧杯内，放于冰槽中。荧光色素准备 按每毫克免疫球蛋白加入荧光素 001rug 计算，称取所需的荧光素，用 3碳酸钠水溶液溶解。将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o4C 冰箱中结合( 最好在磁力搅拌
6、机上持续搅拌)1824h。透析和柱层析 方法同 Marsshall 法。3改良法(1)试剂和材料 001molL(pH7 2)PBS 配法中，校定 pH至 72。NaCi 18g、Na2HP04 115g，溶于 2000ml 蒸馏水05molL(pH90) 碳酸盐缓冲液配法 取05mol LNazCOs(53 )10ml 加入05mol LNaHC03(42 )90ml，混合后，校定 pH 至 90。3碳酸钠水溶液配法 称 L 5g 无水碳酸钠充分溶解于 50ml灭菌蒸馏水中即成。其他试剂和材料 l叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋
7、等。(2)方法及步骤 取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(015molLNaCl)及缓冲液 (05molLNaHC03 Na2C03， pH90) 稀释使每毫升内含蛋白质 lOmg，缓冲液为总量的 10，降温至 4。加入异硫氰酸盐(FITC) 荧光素蛋白：荧光素(5080)mglmg，在 04下电磁搅拌 12 14h。然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用 Nessler 试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。将制备好的荧光抗体加叠氮化钠 o01，分装在 lml 安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4)可以用半年以
8、上，一 20C 保存可达 2 年以上。4透析标记法此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。(1)试剂和材料 试剂和材料同改良法。(2)方法及步骤 用 0025mol L 碳酸盐缓冲液 pH90 ，将欲标记免疫球蛋白稀释成 1浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将 FITC 配成 01mgml 的溶液，按10mgml 球蛋白溶液体积的 10 倍，将 FITC 稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于 FITC 液中。容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在 4C 电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用 SephadexG50 凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于 4中。 F
9、ITCCAS#：3326-32-7中文名：异硫氰酸荧光素英文名：Flourescein iso-thiocyanate；FITC结构式：分子式：C 21H11NO5S分子量：389.38性质：1. 外观：黄色粉末2. 纯度：95% (HPLC)3. 产品描述：FITC 能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。用于医学，农学和畜牧等方面，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。4. FITC 标记抗体流程：（1） 将待交联的蛋白（浓度1mg/mL ）对
10、交联反应液透析三次 4 ，至 pH9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3， 7.36g NaCl，加水定容至 1 L。（2） 将 FITC 溶于 DMSO 中，浓度为 1mg/mL。每次交联使用的 FITC 均应新鲜配制，避光。（3） 按 P:F（蛋白质:FITC）=1mg:150g 的比例将 FITC 缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处 4 反应 8 h。（4） 加入 5mol/L 的 NH4Cl 至终浓度 50mmol/L， 4 终止反应 2 h。（5） 将交联物在 PBS 中透析四次以上，至透析液清亮。（6） 交联物的鉴定蛋白浓度(mg/mL) = A280 0.31A495 / 1.4F/P 比例 : 3.1A495 / A280 0.31A495 ，该值应介于 2.5 6.5 之间。 （7） FITC 交联的蛋白应置于 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液中，加入 0.1% NaN3、 1% BSA，4避光保存。储存条件：4避光保存
