1、冻干保护剂对胶体微粒给药系统包封率和粒径的影响张海龙 097211043摘要：衡量脂质体和 SLN 药物品质的两个重要指标是脂质体和 SLN 包裹药物的粒径分布和包封率，在冷冻干燥过程中脂质体药物的粒径分布和包封率会发生变化。本文综述了冻干保护剂的保护机理，在脂质体和 SLN 冷冻干燥过程中经常使用的四种冻干保护剂葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖，以及这四种不同保护剂、不同浓度在冻干过程中对脂质体和 SLN 粒径和包封率的影响。关键词：冻干保护剂，脂质体，固体脂质纳米粒1 前言胶体微粒系统是靶向给药系统常用的载体，可注射给药，也可制成各种剂型，用于皮肤、鼻腔等粘膜，在生物技术药物的给药中亦起重要作
2、用。脂质体、固体脂质纳米粒（SLN）是胶体微粒系统常用的药物载体。虽然脂质体和 SLN 可以利用其独有的特性将毒副作用大、在血液中稳定性差、降解快的药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的脂质体和 SLN 微粒中，这种微粒与人体细胞膜有相似成分而有良好生物相容性等特点，但它也存在一些缺点，影响着它在临床方面的应用 1。脂质体和 SLN 都是混悬液，易受 pH 值、温度、环境中物质以及包封的药物性质影响 2。在贮存期间易发生聚集、沉降、融合及药物渗漏，且主要脂质材料易氧化、水解，难以满足药物制剂稳定性的要求，使应用受到了很大限制 3。因此，通常采用冷冻干燥法提高脂质体和 SLN 的贮存稳定性。制成冻干
3、脂质体和冻干 SLN 可显著降低脂质和药物的水解和氧化速度。同时，冻干保护剂也保持了脂质体膜结构的完整性，克服脂质体和 SLN 聚集、融合及药物渗漏等不稳定因素，显著提高贮存稳定性。虽然冷冻干燥法对于脂质体和 SLN 的贮存、包装、运输等方面的方便和稳定都不失为一种良好的选择。但在冷冻过程形成的冰晶会使脂质微粒聚集融合，在冷冻和解冻过程中，膜内外冰晶形成速度不同引起渗透压差，造成微粒裂解，所以在冷冻干燥过程中，应加入冷冻保护剂以减少破坏 4。不同种类与浓度的冻干保护剂对脂质体和 SLN 的保护能力各不相同，本文将讨论葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖等作为冻干保护剂，对胶体微粒给药系统的冻干过程进行
4、研究。通过对脂质体和 SLN 冻干前后的包封率和粒径变化来考察冻干保护剂对微粒的保护效果。2 冻干保护剂的保护原理2.1 玻璃化作用所谓玻璃态是物质以非晶体形式存在的一种状态，此状态下物质的粘度极大。玻璃态转化温度(Tg) 是指当溶液浓度达到最大浓缩状态发生玻璃态转化时的温度 5。脂质体和 SLN 冻干过程中玻璃化作用发生在预冻阶段。随冰晶的产生，体系中游离水不断减少，形成玻璃态物质和未冻结水的混合体系。残余的水分越少，最终产物的 Tg 越高。预冻过程中，浓缩的糖溶液能抑制冰晶的生长，减小冰晶嵌入脂质体双层膜的几率，防止膜破裂。且可作为间隔基质阻碍脂质体或 SLN 相互聚集和融合。脂质体和 S
5、LN 冻干品处于玻璃态环境，分子的活动范围和程度受到限制，对提高冻干脂质体和 SLN 的长期稳定性具有重要意义 3。试验表明，当环境温度接近 Tg 时，脂质体和 SLN 会产生药物渗漏，复水后粒径增大；低于 Tg 时，则未见融合和药物渗漏。因此，玻璃态有助于提高冻干品的稳定性 6。葡萄糖冻干保护作用较差的原因之一是该冻干体系的 Tg 较低，如将葡萄糖与羟乙基淀粉合用，可提高冻干体系的 Tg 提高贮存稳定性 7。van Winden 等 8报道以麦芽糖和海藻糖为保护剂制备的冻干脂质体在低于 Tg 的温度贮存时，仍可见脂质体融合及药物渗漏，说明仅保证冻干品处于玻璃态并不一定能提高脂质体和 SLN
6、的稳定性。LI Bao-guo 等 9利用差示扫描量热仪 (DSC)测量了以葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖作为保护剂的脂质体悬浮液的玻璃化转变温度 Tg，结果表明：以海藻糖作为保护剂的脂质体的玻璃化转变温度 Tg 最高为-30.4 ，而以葡萄糖作为保护剂的 Tg 最低为-39。2.2 水置换假说冻干保护剂可与脂质体磷脂的极性基团或 SLN 固体脂质的极性基团形成氢键，脱水后代替水作为脂质体和 SLN 的稳定剂，保持脂质体膜的完整性，抑制药物的渗漏。这种机制称为“水置换假说” 。在无冻干保护剂的情况下，冻干会使冻干品相转化温度（Tm）大幅提高。若加入糖类作为保护剂，则可在膜界面的极性区域代替失去的
7、水，使 Tm 大大降低；随冻干条件的不同 Tm 可高于或低于水化脂质体的结晶温度（Tc） 10。糖与磷脂间的相互作用越强，Tm 越低，保护作用就越强。Tm 降低的程度与冻干品的稳定性有较好的相关性 11。Crowe等 12认为，当蛋白质结构水失去时，海藻糖可在失水部位以羟基和分子形成氢键，及时形成新的保护膜以替代原先失去的结合水膜，这使得分子在缺水条件下仍能保持其原有结构，而不丧失活性。脱水过程中，海藻糖一方面能和磷脂形成氢键，抑止膜泡聚合，另一方面在高温下能有效降低膜相变温度，防止再水化时发生吸水破坏。3 冻干保护剂的性质与分类根据上述对冻干保护机理的分析，冻干保护剂通常应该具有以下几种性质
8、：3.1 结晶率低保护剂在冷冻干燥过程中的结晶通常伴随着相分离，相分离会破坏保护剂分子和脂质分子间的相互作用，从而使保护剂失去保护作用。因此保护剂的结晶率应尽量低，最好能全部或部分玻璃化。3.2 最大冻结浓缩液的玻璃化转变温度 Tg和干物质的玻璃化转变温度 Tg 高按照玻璃化保护机理的分析，保护剂在冷冻干燥和储存过程始终保持玻璃态能最大程度地保护微粒。因此，尽量提高保护剂的 Tg。就允许提高冷冻干燥的操作温度，加速干燥过程而不造成细胞损伤；尽量提高保护剂的 Tg 高于储存温度，就使微粒处于玻璃态的安全温度范围更广，更能适应储存温度波动等不利条件。3.3 吸湿性差玻璃态物质的 Tg 依赖于保护剂
9、自身的特性和水分含量，水是一种良好的增塑剂，玻璃态物质对水分的吸收会使 Tg 显著下降，因此理想的保护剂不仅要求玻璃化转变温度高而且其吸湿性应较低。3.4 不含还原性基团还原性基团能够与脂质发生反应，严重影响微粒的稳定性，因此一般不采用还原性保护剂 13。3.5 冻干保护剂分类常用的冻干保护剂根据其化学性质，可分为：糖类/多元醇：单糖(葡萄糖、半乳糖)、低聚糖(蔗糖、海藻糖 )、多元醇(甘露醇、山梨醇、丙三醇)等；表面活性剂：Tween80 等；氨基酸类(主要是 a-氨基酸) ：甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和组氨酸等；其它类保护剂：抗氧化剂(如维生素 E 等) 、缓冲剂 (如磷酸二氢钾等 )等 3。
10、聚乙二醇(PEG) 、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、聚乙烯亚胺等聚合物也常作为冷冻干燥保护剂。蛋白质类保护剂通常作为生物制品脂质体和 SLN 冷冻干燥保护剂。4 常用冻干保护剂对包封率和粒径的影响最常用冻干保护剂包括糖类中的葡萄糖、蔗糖、海藻糖和多羟基化合物中的甘露醇。M. Glavas-Dodov 等 14研究了冷冻干燥过程对 5-FU 脂质体的影响，作者以包封率和粒径为指标，考察了蔗糖作为冷冻保护剂对 5-FU 脂质体的影响。结果显示：未加保护剂冻干后，脂质体粒径增大，泄露严重；添加蔗糖为冷冻保护剂冻干后，脂质体粒径几乎没有发生变化，而且脂质体的泄露大大减少，说明蔗糖为冷冻保护剂能大大提
11、高脂质体的稳定性。LI Bao-guo 等 9在以葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖作为保护剂的脂质体悬浮液的冻结和冷冻干燥过程中发现，以海藻糖作为保护剂的脂质体的粒径变化最小，以葡萄糖为保护剂的脂质体粒径变化最大。还对脂质体包封水溶性药物喃氟啶和脂溶性药物维生素 A 冻干后脂质体包封率进行了研究。结果显示：以海藻糖为保护剂的脂质体对药品的包封率较高，泄露少，而以葡萄糖为保护剂的脂质体对药品的包封率较低，泄露多。李珺婵 15采用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖作为冻干保护剂，考察其对9-硝基喜树碱纳米脂质载体系统的影响。实验结果显示，与葡萄糖、蔗糖、甘露醇相比，用海藻糖作为冻干保护剂，其冻干粉重分散后粒
12、径变化较小，具有较好的重分散性。作者还研究了 2%、5%和 10%三种不同浓度海藻糖溶液对 9-硝基喜树碱纳米脂质载体系统的包封率和粒径的影响。实验结果显示，用 5海藻糖溶液作为冻干保护剂制备 9-NC-NLC 冻干粉，其包封率的变化及冻干粉重分散后粒径变化均较其他两种浓度较小。张丽霞等 16以以冻干品再分散后的粒径、包封率为评价指标，考察了葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖作冻干保护剂对两性霉素 B 长循环脂质体冻干品的影响。结果显示葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖作为冻干保护剂对脂质体冻干过程中的粒径都有保护作用，海藻糖对两性霉素 B 长循环脂质体的保护作用，明显好于葡萄糖和甘露醇，略好于蔗糖。苏树
13、强等 17研究了不同保护剂对 HB-Ia 脂质体冻干前后包封率的影响。结果显示：在对 HB-I a 脂质体包封率的提高与冻干保护方面，蔗糖及甘氨酸、麦芽糖、甘露醇均显示良好的效果，其中蔗糖及甘氨酸所组成的二元保护剂效果最好，麦芽糖、甘露醇保护效果稍差，而保护剂葡萄糖和 PVP 实际运用效果不佳；在保护剂使用过程中，过高或过 低的蔗糖或麦芽糖浓度均对提高冻干 HB-I a 脂质体的包封率不利，而甘露醇浓度稍低时对提高冻干 HB-I a 脂质体的包封率有利。同时，作者以粒径为指标考察了不同保护剂对 HB-Ia 脂质体冻干前后的影响，结果显示，蔗糖的保护效果较优，甘露醇次之，PVP 和甘氨酸相对较差
14、，蔗糖和甘氨酸组成的二元保护剂保护效果较蔗糖更好 18。郭丹 19在 Nobiliside A 冻干脂质体的研究中发现：甘露醇的成型性最好，但是复溶性差，且粒子聚合和粒径增大的几率增大；山梨醇的成型性以及复溶性均较差；海藻糖、蔗糖的成型性、复溶性以及粒径分布均较好；乳糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖作为保护剂在冻干的过程中有严重的起泡现象；当甘露醇和蔗糖合用时，虽然平均粒径符合要求，但是粒径分布较宽，且有大粒子存在。刘占杰等 1在研究不同保护剂、不同保护剂浓度在冻干过程中对脂质体粒径的影响中发现：以葡萄糖作保护剂的脂质体粒径最大，以海藻糖作保护剂的脂质体粒径最小；并且不同浓度保护剂的保护效果也不同，对
15、于每种保护剂都有最佳保护浓度，葡萄糖为 5，蔗糖为 10，甘露醇为 15，海藻糖为10，葡萄糖浓度为 5的脂质体冻干前、冻干后的平均粒径分别为0.592um、0.749um；蔗糖浓度为 10的脂质体冻干前、冻干后的平均粒径分别为 0.592um、0.751um；甘露醇浓度为 15的脂质体冻干前、冻干后的平均粒径分别为 0.376um、0.426um；海藻糖浓度为 10的脂质体冻干前、冻干后的平均粒径分别为 0.264um、0.294um。李茗等 20对以冻干品的外观、重建粒子形态以及 40初步稳定性为指标，分别考察了乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇 5 种保护剂单用及合用对尼莫地平鼻用冻干脂
16、质体的保护作用。结果表明：甘露醇与蔗糖(3：2)合用所得冻干品有良好的外观、粒子形态和稳定性甘露醇与葡萄糖(3：2)合用则外观较差。当甘露醇与磷脂为 3：1，蔗糖与磷脂分别为 1：1、2：1、3：1 制得的冻干品，重建后粒径均无明显变化。随着蔗糖比例的增加，药物泄漏明显减少，但外观变差。侯冬枝等 21在米非司酮固体脂质纳米粒冷冻干燥性能的研究中，分别为葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖为冷冻保护剂，在相同的添加量下，比较冻干后的包封率相对于冻干前包封率（88%）差距。结果显示：葡萄糖作为冷冻保护剂的包封率减少为 53%；蔗糖作为冷冻保护剂的包封率减少为 66%；甘露醇作为冷冻保护剂的包封率减少为 6
17、4%；海藻糖作为冷冻保护剂的包封率减少为 75%。同时作者研究了添加不同浓度冻干保护剂海藻糖的 4 个试样，结果显示，添加任何浓度的海藻糖保护剂试样的包封率均远远大于不添加保护剂，其中以 20%浓度海藻糖样品的保护作用最好。毕茹 22在胰岛素固体脂质纳米粒肺吸入粉雾剂的研制中筛选考察了葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇作为冷冻保护剂对 SLN 粒径及包封率的影响。结果发现：乳糖组经冻干后粘性较大，复溶后纳米粒难以均匀分散；蔗糖组最较为蓬松，含有大量细小的不透明片状物，粉体流动性差；而甘露醇组喷雾冻干后很蓬松，通过显微镜下观察，仍可看到大量的针状结晶，不利于药物稳定；葡萄糖组喷雾冻干后较蓬松，粉末加入蒸
18、馏水后可迅速溶解成纳米粒混悬液，但流动性较差。另外，各组复溶后 SLN 包封率为乳糖：23.58% ；蔗糖：56.17%；葡萄糖：62.33%；甘露醇 40.24%。胡连栋等 23选用不同辅料作为冻干保护剂，制备维甲酸固体脂质纳米粒冻干品，考察了不同制品的外观、粒径、包封率。结果表明：从外观和粒径两方面综合考虑，单独应用以上几种保护剂，效果依次为：蔗糖海藻糖乳糖 甘露醇右旋糖酐。选择蔗糖、蔗糖+ 海藻糖、甘露醇+ 海藻糖、甘露醇+蔗糖为冻干保护剂，冻干纳米粒再分散后粒径减小，包封率与冻干前相比有所降低，含海藻糖处方可大大加快纳米粒的再分散速率。Lijuan Zhang, Lei Liu, Yu
19、 Qian 等 24研究了不同冻干保护剂对布洛芬固体脂质纳米粒的影响，以包封率为指标，分别考察了海藻糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇对 SLN 包封率的影响。结果显示：海藻糖和葡萄糖较蔗糖和甘露醇能够显著显著降低 SLN 的泄露率。5 结语不同保护剂及不同保护剂浓度对冻干过程中不同脂质体和 SLN 粒径分布及包封率的影响程度不同。总的来说，加入冻干保护剂后脂质体和 SLN 在冻干前后的粒径变化较未加冻干保护剂变化幅度要小。而且加入冻干保护剂后，药物的泄漏率减少，包封率降低程度减少，提高了脂质体和 SLN 的稳定性。冻干保护剂合用效果一般比单独使用保护效果要好。综合比较后发现，常用冻干保护剂中，海藻糖的
20、保护效果较好，葡萄糖的保护效果最差。参考文献1刘占杰,华泽钊 ,李保国.冷冻干燥过程中保护剂对脂质体粒径影响的实验研究.第六届全国冷冻干燥会议论文集,2000,11:46-50.2苏树强,华泽钊 ,丁志华等. HB-Ia 冻干脂质体粒径及其分布的研究.中国医药工业杂志, 2004,35(3):154-157.3王健,李明轩 .冷冻干燥对提高脂质体稳定性的研究概况.中国医药工业杂志, 2005,36(9):576-580.4刘娟,胡水根 ,卞俊.冻干保护剂对 HB 有效组分脂质体包封率和粒径的影响.时珍国医国药,2007,18(9):2119-2121.5朱敖兰,杨洁 ,ZHU Ao-lan.生
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