1、江苏省科技计划项目验收报告项 目 名 称 ： 水溶性水飞蓟素提取加工技术研究及产品开发项 目 编 号 ： BE2006321 项 目 负 责 人 ： 何尔群 承 担 单 位 ： 江 苏 健 佳 药 业 有 限 公 司 起 止 年 限 ： 2006 年 1 月2008 年 12 月 目 录一、原计划合同内容二、项目实施工作总结报告（包括技术总结）1水溶性水飞蓟素提取工艺研究2水溶性水飞蓟素提取与加工技术路线3水溶性水飞蓟素化学成分的分析4水溶性水飞蓟素产品质量标准的研究与制定三、技术成果1研究论文发表情况2专利申请情况3技术特点四、经费使用情况五、附件一、原计划合同内容1、主要研究内容本项目是从
2、水飞蓟籽中提取水溶性水飞蓟素。通过对原料的预处理、水溶性水飞蓟素的提取、包合技术、澄清、分离、浓缩、干燥等过程的研究与改进，确定水溶性水飞蓟素的提取工艺条件，明确该产品的含量指标及一般理化指标，并完成中试，使水溶性水飞蓟素产品达到工业化生产水平。制定水溶性水飞蓟素的质量标准，填补国内这一领域的空白。2、主要技术指标(1) 确 定 水 溶 性 水 飞 蓟 素 提 取 工 艺 条 件 ， 完 成 中 试 ， 达 到 工 业 化 生 产 水平 ；(2) 制定水溶性水飞蓟素的质量标准；(3) 发表论文 23 篇。3、参加人员项目承担单位：江苏健佳药业有限公司项目参加单位：江苏省中科院植物研究所项目负责
3、人：何尔群姓 名 性别 年龄 职 称 /职务 从事专业为本项目工作时间（%）所在单位何尔群 男 56 高级工程师 药 学 80 江苏健佳药业有限公司李维林 男 40 研究员 药 学 30 江苏省中科院植物研究所主要研究人员周志清 男 51 经济师 经济管理 30 江苏健佳药业有限公司徐伯衡 男 42 高级工程师 药 化 60 江苏健佳药业有限公司吴振祥 男 54 主任药师 药 化 60 江苏健佳药业有限公司任冰如 女 42 研究员 植物化学 40 江 苏 省 中 国 科 学 院 植 物 研 究 所梁呈元 男 34 助理研究员 植物资源 60 江 苏 省 中 国 科 学 院 植 物 研 究 所4
4、、经费预算1). 经费来源预算单位：万元合计 2006 年 2007 年 2008 年 备注合计 200 90 60 501、省拨款 25 252、部门、地方配套3、承担单位自筹 175 65 60 504、银行贷款5、其他来源2). 项目经费支出预算单位：万元预算数 占预算支出总额的比重(%) 备注合计 2001、人员费 3 1.52、设备费 90 453、能源材料费 88 444、试验外协费 5 2.55、差旅费 2 16、会议费 2 17、管理费 5 2.58、基建费 2.0 2.09、其他相关费用10、测试及试验费 5 2.5二、项目工作总结（包括技术总结）1、水溶性水飞蓟素提取工艺研
5、究(1) 原料的预处理水飞蓟种子榨油。水飞蓟油可以制作色拉油具有色清、味纯、沸点低、易被人体吸收等特点，有保肝养胃功能，无任何毒副作用，是一种高级保健食用油。榨油后的水飞蓟饼用于提取水溶性水飞蓟素。提取水溶性水飞蓟素后渣饼富含淀粉、蛋白质，因不含任何有机溶剂，经适当加工后即能形成营养成份较高的天然饲料，是养禽、养猪、喂养水产品的极佳饲料。(2) 水溶性水飞蓟素的提取采用碱水的醇溶液为溶剂，以水溶性水飞蓟素的得率和水飞蓟宾含量为工艺考察指标，以提取时间、提取温度、溶剂用量、pH 值为实验因子，通过单因素试验和正交试验，研究并优选出了水溶性水飞蓟素的最佳提取工艺条件。材料与仪器水飞蓟种子采自于江苏
6、东台本公司种植基地，由江苏省中国科学院植物研究所李维林研究员鉴定为菊科植物水飞蓟 (紫花) ( Silybum marianum (L.) Gaertn) 的种子。Mettler AE240 电子天平，KQ-100DE型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司），北京普析通用TU-1901紫外-可见分光光度计，Shimadzu高效液相色谱仪（LC-20A泵，SPD-20A紫外检测器）等。水飞蓟宾标准品（含量99.5，HPLC 纯，中国药品生物制品检定所），其余试剂均为分析纯。方法与结果水溶性水飞蓟素提取工艺的单因素试验1). pH 值对水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量的影响分别称取水飞蓟饼 500g
7、，分别加入不同 pH 值的 30%的碱乙醇1500ml，于 80提取 3 遍，合并滤液，浓缩成到流膏，体积在 500ml时，加入 40g 101 澄清剂，搅匀，静置 1h 后，分离上清液，浓缩真空干燥，得粗品，再加入 20 倍体积纯化水，充分溶解，离心分离上清液，真空浓缩得成品。称取成品重量，计算得率。另取成品 50mg，精密称定，置 100ml 量瓶中，加甲醇适量，水浴加热使溶解，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取对照品溶液和供试品溶液各 5ml，分别置 25ml 量瓶中，分别精密加2，4- 二硝基苯肼溶液（取 2，4-二硝基苯肼 0.5g，置 50ml 量瓶中，加硫酸 1ml 使
8、溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀）2ml ，置 50-55水浴中反应 50 分钟，冷却，加氢氧化钾-甲醇溶液（取氢氧化钾 10g，置100ml 量瓶中，加水 30ml 使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀）稀释至刻度，摇匀，离心 10 分钟，精密量取上清液 5ml，置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，照分光光度法（中国药典 2005 年版地附录） ，在 490nm 的波长处分别测定吸收度，计算，即得水飞蓟素含量。另取本品 0.11g，精密称定，置 50ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取 5ml，置 50ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取经 60减
9、压干燥 3 小时的水飞蓟宾对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每 1ml 中约含 0.1mg 的溶液，作为对照品溶液。精密吸取上述两种溶液各 5l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以水飞蓟宾与异水飞蓟峰面积之和计算。试验结果如下图所示。pH值 对 水 溶 性 水 飞 蓟 素 得 率 和 水 飞 蓟 宾 含 量 的 影 响0%5%10%15%20%25%30%10 9 8.5 8pH值得 率水 飞 蓟 素 含 量水 飞 蓟 宾 含 量由图可以看出，随着碱水 pH 值的下降，水飞蓟素和水飞蓟宾的含量明显上升，可能是由于 pH 太高会破坏黄酮母核，导致含量下降，故碱水提取的 pH 采用在 8
10、-8.5 为宜。2). 提取温度对水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量的影响分别称取水飞蓟饼500g，加入pH值为8的30%的碱乙醇1500ml，于90、80和70各提取3遍，合并滤液，浓缩成到流膏，体积在500ml时，加入40g 101澄清剂，搅匀，静置1h后，分离上清液，浓缩真空干燥，得粗品，再加入20倍体积纯化水，充分溶解，离心分离上清液，真空浓缩得成品。同1) 法分别测定水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量。试验结果如下图所示。提 取 温 度 对 水 溶 性 水 飞 蓟 素 得 率 和 水 飞 蓟 宾 含 量 的 影 响0%5%10%15%20%25%30%90 80 70温 度得 率水 飞
11、蓟 素 含 量水 飞 蓟 宾 含 量由图中可以看出，随着温度的降低，水飞蓟素和水飞蓟宾含量在80达到最高，且此时水和乙醇的公沸点接近，故采用提取温度在80为宜。提取水溶性水飞蓟素的正交试验在前期经验的基础上，选择碱水的乙醇液为溶剂，以乙醇用量、乙醇浓度、提取时间为实验因素，每个因素设3个水平，进行L 9(34)正交实验。正交实验的因素和水平因素水平溶剂用量（倍）A 乙醇浓度（%）B 提取时间（h）C1 6+6+4 40 1.0+1.0+1.02 8+8+6 35 1.5+1.5+1.53 10+10+8 30 2.0+2.0+2.0取榨油后的水飞蓟饼，分别精密称取9份，各500.00g。按表选
12、择的条件分别加入pH8的碱水的乙醇液，于 80提取3遍，合并滤液，浓缩成流膏，体积在500ml 时，加入40g 101 澄清剂，搅匀，静置1h后，分离上清液，浓缩真空干燥，得粗品，再加入20倍体积纯化水，充分溶解，离心分离上清液，真空浓缩得成品。加热回流提取，合并提取液，过滤，浓缩，回收乙醇，水浴（60）蒸至近干，再于真空干燥箱中（60 ）干燥，干燥器中冷却0.5h后迅速称重，粉碎成粉末。水飞蓟宾的含量测定方法（HPLC法）及水飞蓟素的含量测定方法（UV法）同上1)法。对照品溶液的配制和标准曲线的建立精密称取水飞蓟宾标准品适量，以甲醇溶解并配制成含水飞蓟宾浓度为0.216 mgml -1的溶液
13、。取对照品溶液10，12，14，16，18，20l，分别进样，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。Y=4.3066410 5X+ 2.9658104，r=0.9999 。结果表明水飞蓟宾在 2.164.32g内线性关系良好。数据处理及结果对正交实验结果采用综合评价方法，即以水飞蓟宾的含量加权系数0.6、水溶性水飞蓟素成品得率加权系数0.4作为综合评价指标。综合评价分值= 水飞蓟宾含量0.6+水飞蓟素0.4，结果下表。方差分析结果见表，表明乙醇浓度、提取时间对实验结果有显著影响，其中乙醇浓度（B）影响最大，其次是提取时间（C ）
14、，溶剂用量（A ）影响较小。由表2直观分析综合评价 R值，最佳提取工艺是A3B2C2，即 30%乙醇提取三次，每次提取2h，前两次加8倍量乙醇，第三次加6倍量乙醇。以最佳工艺进行验证实验，结果表明该工艺重复性和稳定性好，适于大生产。正交实验结果影响因素实验号A B C D 水飞蓟宾(%) 水飞蓟素(%) 综合评价1 1 1 1 1 9.21 19.6 13.3662 1 2 2 2 8.89 21.7 14.0143 1 3 3 3 9.45 20.8 13.9904 2 1 2 3 10.23 22.6 15.1785 2 2 3 1 10.34 23.8 15.7246 2 3 1 2 1
15、1.28 25.2 16.8487 3 1 3 2 10.67 24.3 16.1228 3 2 1 3 12.09 25.9 17.6149 3 3 2 1 11.76 25.6 17.296K1 10.895 10.780 10.829 11.047K2 11.987 11.372 10.190 11.043K3 11.194 12.924 11.054 10.984R 0.299 0.592 0.362 0.063方差分析方差来源 SS f S F P溶剂用量 A 0.140454 2 0.07023 17.7008 0.05乙醇浓度 B 0.571414 2 0.28571 72.01
16、28 99.5，HPLC 纯，中国药品生物制品检定所）； 水 溶 性 水 飞 蓟 素 产 品 由 本 公 司 自 制 ， 批 号 为20070921、 20071108、 20071209。岛 津 LC-10A高 效 液 相 色 谱 仪 ； 日 本 岛 津 SPD-10A检 测 器 ； 浙 江 大 学N2000色 谱 工 作 站 ； METTLER AE240电 子 天 平 。甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。方法与结果色谱条件色谱柱AichromBond-C18(5m，4.6 250 mm)；以甲醇-水-冰醋酸（50：50：0.5）为流动相，检测波长为288nm ，理论板数按水飞
17、蓟峰计算应不低于5000。对照品溶液的制备精密称取经60减压干燥3小时的水飞蓟宾对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml 中约含0.1mg水飞蓟宾的溶液，作为对照溶液。 供试品溶液的配制取本品0.11g，精密称定，置50ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml ，置50ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。线性关系考察取对照品溶液2、4、6、8、10l，分别进样，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程得水飞蓟宾：Y=871.66X-0.4488，r=0.9999。结果表明水飞蓟宾含量在 0.0
18、200.100g 内线性关系良好。精密度实验取对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，每次5L，水飞蓟宾的峰面积RSD为1.09%，说明该方法精密度良好。重复性试验取水溶性水飞蓟素产品（批号20070921）共6份，分别前述样品溶液制备方法和色谱条件操作，计算含量。结果显示水飞蓟宾的平均含量为11.129%，RSD=1.1% ，说明该方法有良好的重复性。加样回收率测定准确称取水溶性水飞蓟素产品（批号20070921，其中水飞蓟宾含量为11.129% ）5份，每份 10.0mg，分别精密加入水飞蓟宾对照品溶液25ml（浓度为0.010032mgml -1） ，精密加入甲醇至50ml, 按前述样
19、品溶液制备方法及色谱条件和测定方法，进行含量测定。结果显示水飞蓟宾平均回收率为97.28%，RSD=1.0% ，说明该法回收率良好。样品分析精 密 称 取 各 批 次 样 品 各 3份 ， 按 前 述 样 品 溶 液 制 备 方 法 及 色 谱 条 件和 测 定 方 法 ， 测 定 水 飞 蓟 素 含 量 ， 用 外 标 法 ， 根 据 峰 面 积 计 算 含 量 ， 结果 其 含 量 分 别 为 11.364%， 10.865%， 11.250%。结论与讨论在本实验所确定的条件下，水溶性水飞蓟素产品中的主要成分水飞蓟宾能很好地分离，且重现性、精密度较好，可以作为水溶性水飞蓟素的质量控制方法。
20、（2）水溶性水飞蓟素产品质量标准的制定根据以上研究结果，制定水溶性水飞蓟素产品质量标准如下：水溶性水飞蓟素质量标准本品为菊科植物水飞蓟 (Silybum Marianum (L.) Gaertn)的果实，经提取所得的松散粉末，按干燥品计含水飞蓟素以水飞蓟宾计算 (C25H22O10) 不得少于 25.0%，含水飞蓟宾和异水飞蓟宾不得少于10.0%。性状本品为淡黄色至浅棕色的松散粉末，在水中溶解。鉴别取本品 0.1 克，加甲醇 10ml，振摇，滤过，取滤液，照下述方法试验。(1) 取滤液 1ml，加锌粉少许及盐酸数滴，即显玫瑰红色。(2) 取滤液 2ml，加醋酸铅试液 1ml，即产生黄色沉淀。(
21、3) 取滤液适量，用甲醇稀释制成每 1ml 中约含 16ug 的溶液，照分光光度法 (中国药典 2005 年版二部附录 ) 测定，在 288 nm 的波长处有最大吸收。检查溶解性 取本品 1 克，加纯化水 200ml 振摇溶解，应澄清。干燥失重 取本品，在 70减压干燥 3 小时，减失的重量不得超过 5.0%（中国药典 2005 年版二部附录 ）炽灼残渣 不得过 0.5%（中国药典 2005 年版二部附录 ）重金属 取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查（中国药典 2005年版二部附录 第二法） ，含重金属不得过 20ppm。含量测定 水飞蓟素（总黄酮）对照品溶液的制备 取水飞蓟宾对照品约 10m
22、g，精密称定，置 25ml 量瓶中，加甲醇适量，水浴加热使溶解，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。供试品溶液的制备 取本品 50mg，精密称定，置 100ml 量瓶中，加甲醇适量，水浴加热使溶解，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。测定法 精密量取对照品溶液和供试品溶液各 5ml，分别置 25ml量瓶中，分别精密加 2，4-二硝基苯肼溶液（取 2，4- 二硝基苯肼0.5g，置 50ml 量瓶中，加硫酸 1ml 使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀）2ml，置 50-55水浴中反应 50 分钟，冷却，加氢氧化钾 -甲醇溶液（取氢氧化钾 10g，置 100ml 量瓶中，加水 30ml 使溶
23、解，加甲醇稀释至刻度，摇匀）稀释至刻度，摇匀，离心 10 分钟，精密量取上清液5ml，置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，照分光光度法（中国药典 2005 年版地附录） ，在 490nm 的波长处分别测定吸收度，计算，即得。水飞蓟宾 照高效液相色谱法（2005 年版二部附录 V D）测定。色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇- 水- 冰醋酸（50 ：50：0.5）为流动相，检测波长为 288nm，理论板数按水飞蓟峰计算应不低于 5000。测定法 取本品 0.11g，精密称定，置 50ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取 5ml，置 50ml
24、 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取经 60减压干燥 3 小时的水飞蓟宾对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每 1ml 中约含0.1mg 水飞蓟宾的溶液，作为对照品溶液。精密吸取上述两种溶液各5l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以水飞蓟宾与异水飞蓟宾峰面积之和计算。类别肝病辅助用药。贮藏遮光，密闭，在阴凉处保存。制剂针剂，冲剂。有效期2 年。三、技术成果1、研究论文发表情况(1) Yong-ping Pei, Jian Chen, Wei-lin Li, et al. Progress in Research and Application of Silyma
25、rin. Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology, in press(2) 陈剑，李维林，任冰如等. 水溶性水飞蓟素提取工艺的改进与探讨. 植物资源与环境学报，已接收2、专利申请情况专利申请号 200710106033.43、技术特点（1）目前国内普遍的水溶性水飞蓟素提取方法是加入葡甲胺，让水飞蓟素和葡甲胺进行化学合成所得，产品虽然溶于水，但副作用较大，对人体肾功能有阻碍作用，在国际上不能被客户接受。本项目研究利用了黄酮类物质在碱水中溶解的特性，再在无有机溶剂的条件下及时包合，保证黄酮在后道工序不被破坏，所得产品溶于水，副作
26、用较小，在国际上能够被客户接受。 （2）提出了水溶性水飞蓟素的提取新工艺，并制定了相应的产品质量标准，明确了该产品的含量指标及一般理化指标，填补了国内这一领域的空白。（3）本项目的研究技术在实施时，可以产生两个极富利用价值的副产品水飞蓟色拉油和水飞蓟饼饲料，有利于水飞蓟的综合利用。四、经费使用情况 单位（万元）1、人员费 6 6、会议费 1.52、设备费 222 7、管理费 3.53、能源材料费 91 8、基建费4、试验外协费 20 9、其他相关费用 2.55、差旅费 1.5 10、测试及试验费 6五、附件1、江苏省科技计划项目合同书和项目计划任务书；2、科技研发工作总结（包括技术报告） ； 3、项目经费决算表； 4、项目所获成果、专利一览表；5、研制样品的图片及数据；6、产品检测（测试）报告； 7、建设中的生产线图片及数据；8、购置的仪器、设备等固定资产清单；9、证明经济效益指标的产品销售合同等材料；10、产品质量标准。
